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Embora a toxoplasmose seja amplamente estudada em animais domésticos e humanos, sua prevalência, distribuição e impacto em espécies silvestres ainda são pouco compreendidos, especialmente em regiões com alta biodiversidade. O presente estudo busca preencher essa lacuna, investigando a ocorrência de T. gondii em animais silvestres, destacando sua importância ecológica, epidemiológica e sanitária. Ademais, a realização do projeto é necessária visto que animais silvestres podem atuar como reservatórios e contribuindo para a manutenção do ciclo de transmissão (Dubey, 2002).
Portanto, a análise da ocorrência de toxoplasmose em animais silvestres não apenas amplia o conhecimento sobre a epidemiologia da doença, mas também fornece subsídios para ações integradas de saúde única, unindo esforços na proteção da biodiversidade, saúde animal e humana. A realização deste estudo é um passo fundamental para mitigar os impactos negativos do T. gondii em ecossistemas naturais e populações vulneráveis.

Para este estudo serão coletadas amostras de sangue, fezes ou órgãos de pelo menos 2
50 animais silvestres provenientes de instituições mantenedoras e/ou mortos por atropelamento de diversas espécies, pertencendo a classe dos mamíferos, aves ou répteis. Ademais, será realizada coleta de dados sobre a dieta, habitat e outras variáveis ambientais dos indivíduos estudados.
Os animais atropelados serão necropsiados e fragmentos dos tecidos de cérebro, rins, intestino, fígado, coração, pulmão, baço e, em aves, moela serão conservados em glicerina 10% e destinados ao Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) mantidas armazenadas em tubos Falcon 50 mL e tubos de 2 mL tipo Eppendorf em freezer a -20 ºC ou -80 ºC até a realização da pesquisa. Amostras de sangue serão conservadas em tubos de coleta de 0,5 mL ou 4 mL com EDTA, mantidas em freezer juntamente com os demais materiais biológicos e fragmentos de fezes serão armazenados em formol 10%.
Esse estudo será submetido ao Comitê de Ética em Experimentação Animal desta Instituição e ao Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen), além da solicitação para coleta de amostras ao Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SisBio).
A extração do DNA das amostras de sangue e/ou tecidos dos animais será realizada utilizando-se o protocolo in house (utilização de 2 uL de proteinase K e 800 uL de fenol-clorofórmio). O DNA será estocado em freezer a -20 ºC ou -80 ºC até ser utilizado nos experimentos. As amostras serão descongeladas com a utilização de Banho Maria e a quantificação da concentração e pureza do DNA será avaliada em espectrofotômetro (Nanodrop) e obtidos valores em nanogramas por microlitros (ng/uL). A amplificação de DNA será feita por meio de termocicladores convencionais Bio-Rad, T100 (termocicladores convencionais Eppendorf) ou termocicladores Applied Biosystems.
A amplificação do DNA será realizada pela técnica de PCR nested com os primers já descritos na literatura para T. gondii: Toxo 1 (5’ AGC GTC TCT CTT CAA GCA GCG TA 3’) e Toxo 2 (5’ TCC GCA GCG ACT TCT ATC TCT GT 3’) para primeira reação e Toxo 3 (5’ TGG GAA TGA AAG AGA CGC TAA TGT G 3’) e Toxo 4 (5’ TTA AAG CGT TCG TGG TCA ACT ATC
O mix para primeira PCR conterá 25 uL como volume final, consistindo em uma mistura de KCl, Tris-HCl, MgCl2, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, primers TOXO 1 e TOXO 2 e Taq DNA polymerase. Será realizada uma desnaturação inicial por três minutos a 94 ºC, seguida de um ciclo de 45 segundos de desnaturação a 94 ºC, anelamento a 55 ºC por um minuto e extensão a 72 ºC por 30 segundos, totalizando 25 ciclos, e será realizada uma extensão de 10 minutos para finalizar a primeira reação.
Para reação nested será utilizado um mix de mesmo volume adicionado ao mix anterior, contendo água mili-Q, KCl, Tris-HCl, MgCl2, deoxynucleotídeos, primers TOXO 3 e TOXO 4 e Taq DNA polimerase. Serão 35 ciclos para segunda reação, da mesma forma que a primeira foi realizada. Ao fim do PCR, 10 uL do mix de reação, juntamente com 3 uL de brometo de etídeo (0,5 ug/mL), serão depositados em poços de gel de agarose 2% e analisados por eletroforese em cuba de eletroforese. Como controle negativo será depositado em um dos poços H20 free
e para controle positivo serão utilizadas amostras já disponíveis no LaBMol-Vet. Os produtos amplificados serão visualizados em luz ultravioleta e fotografados em aparelho transiluminador. Serão utilizados padrões de peso molecular de 100 pb. As amostras serão consideradas positivas a partir da visualização de fragmentos com bandas específicas referentes ao par de primers.
Além disso, será realizada imunofluorescência indireta de amostras coletadas do cérebro e sangue da ordem de animais de maior ocorrência nesse estudo, conforme literatura disponível (Kang et al., 2023).
Os dados serão inseridos na plataforma Microsoft Excel e estatisticamente analisados utilizando o software Graphpad Prism versão 10.0 através de análises de correlações. Os resultados serão considerados estatisticamente significativos quando p<0,05.

Identificar a presença de Toxoplasma gondii em diferentes espécies de animais silvestres dos Pampas Gaúchos.
Caracterizar as cepas circulantes e relacionar os achados com focos de contaminação por Toxoplasma gondii na biodiversidade e na saúde dos ecossistemas.