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Nome do Projeto
Identificação antígenos candidatos para vacina e diagnóstico com base na vacinologia reversa e estrutural e na imunoproteoma de Leptospira spp.
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
21/12/2017 - 17/12/2025
Unidade de Origem
Centro de Desenvolvimento Tecnológico
Coordenador Atual
ALAN JOHN ALEXANDER MCBRIDE
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Os esforços para identificar e controlar as fontes ambientais de transmissão são complicados pelo fato de que os leptospiras sobrevivem no solo e na água e mantêm a infectividade por vários meses. A leptospirose rural é considerada difícil, senão impossível, de controlar devido ao amplo espectro de reservatórios de animais e à transmissão contínua entre hospedeiros silvestres e domésticos. No ambiente urbano, as intervenções visaram o reservatório doméstico de ratos. No entanto, a alta densidade de ratos torna as intervenções químicas e ecológicas dispendiosas. Além disso, os ratos domésticos tornaram-se cada vez mais resistentes aos pesticidas. Embora não reconhecidos internacionalmente, epidemias urbanas ocorreram no Brasil desde a década de 1960. As vacinas são um grande foco de pesquisa devido à falta de medidas de controle efetivas. A imunização com leptospiras inteiras inativadas (bacterinas) foi bem documentada para proteger os animais experimentais contra a infecção por desafio. Acredita-se que a imunidade se deve a anticorpos anti-lipopolissacarídeo (LPS); a transferência passiva destes anticorpos confere proteção. As bacterinas são rotineiramente utilizadas em animais veterinários e são recomendados reforços anuais. Vários países desenvolveram bacterinas para uso humano e, em ensaios clínicos, a eficácia dessas vacinas foi relatada para variar entre 75 e 97%. No entanto, existem preocupações significativas com as vacinas baseadas em bacterinas em geral. Eles foram relatados para causar reações adversas graves e para conferir apenas imunidade a curto prazo. Além disso, a imunidade é serovar específica e existem >250 sorovares patogênicas. As bacterinas não são licenciadas para uso fora de seus respectivos países, mostrando a necessidade de identificar novas abordagens para o desenvolvimento da vacina.

Objetivo Geral

Nosso objetivo é investigar a hipótese de que novos antígenos de leptospiras possam ser descobertos pela aplicação de imunoproteômica a células de leptospira adaptadas in vivo.

Objetivos específicos
(a) Desenvolver cepas de Leptospira adaptadas ao hospedeiro em um modelo de rato;
(b) Realizar imunoprecipitação de leptospiras intactas adaptadas ao hospedeiro com soro humano de pacientes com leptospirose;
(c) Identificar novos antígenos de leptospiras expostos à superfície usando vacinação reversa e estrutural;
(d) Investigar o potencial de vacina de 20 antígenos identificados em (c);
(e) Avaliar o potencial diagnóstico de 10 antígenos identificados em (c).

Justificativa

A leptospirose é uma zoonose causada por espiroquetas, a qual tem se disseminado de zonas rurais para centros urbanos de países em desenvolvimento causando grandes epidemias. Recentemente, a OMS estimou que a incidência real da doença é 13.8/100000 ou 28000 casos severos/ano no Brasil. Ferramentas de diagnóstico inadequadas, além de precárias medidas controle da doença são importantes barreiras para saúde pública. Um forte agravante ocorre com o surgimento de síndrome hemorrágica pulmonar (SHP) severa, a qual é a principal causa de morte no Brasil durante epidemias. A mortalidade devido a doença de Weil e SHP é 5-40% e >50%, respectivamente. Além do mais, o custo de monitoramento em UTI, diálise e ventilação mecânica são fardos pesados no Brasil, onde o gasto com saúde pública é
Novas estratégias para a identificação de candidatas vacinais: Vacinas de subunidades representam uma estratégia alternativa e oferecem várias vantagens potenciais: 1) O uso de proteínas definidas evita reações adversas associadas às bacterinas; 2) Essas proteínas podem induzir respostas a longo prazo e não são susceptíveis de induzir anticorpos aglutinantes; e 3) Uma vacina com proteção cruzada pode ser desenvolvida usando proteínas conservadas entre todos os sorovares patogênicos. Uma estratégia de vacina de subunidade foi utilizada para desenvolver a vacina OspA para a doença de Lyme e a vacina 4CMenB para a doença meningocócica tipo B. No entanto, a falta de correlatos de imunidade e um sistema de manipulação genética para Leptospira spp. dificultou a identificação de alvos vacinais. As abordagens atuais têm se concentrado na identificação de proteínas expostas na superfície que podem servir como alvos para respostas imunitárias bactericidas. Os parceiros Brasileiros, juntamente com seus colaboradores na Fiocruz, identificaram várias proteínas expostas à superfície, ex. LigA e LemA que podem induzir uma resposta imune protetora no modelo hamster de leptospirose aguda. Recentemente, demonstraram que o LigB, conservado em todas as Leptospira patogênicas, induziu a imunidade esterilizante no modelo hamster. No entanto, estas proteínas não conferem proteção cruzada, mesmo quando a identidade da proteína é > 90%. Continua a existir uma necessidade urgente de identificar novas candidatas vacinais, capazes de estimular a imunidade de proteção cruzada. Recentemente, utilizaram vacinologia reversa e estrutural para identificar 26 antígenos associados à superfície no genoma do L. interrogans sorovar Copenhageni que são conservados entre as Leptospira patogênicas. Estas proteínas serão avaliadas como candidatas vacinais e para o desenvolvimento de novos diagnósticos.

Metodologia

O objetivo é testar aproximadamente 6 dos antígenos mais promissores (localizados na superfície, conservados entre cepas, geradores de soro opsonofagocítico). Proteínas recombinantes serão adsorvidas com adjuvante de hidróxido de alumínio (Alhydrogel) e hamsters serão imunizados pela via intramuscular nos dias 0 e 14, com 80 e 40 μg. Sangue será coletado nos dias -1 e 28 para determinar o título de anticorpos. Hamsters serão desafiados com a dose letal de leptospiras (homólogas e heterólogas) no dia 29. Os hamsters serão avaliados diariamente para o desenvolvimento de sinais de leptospirose baseado no escore clínico (sinais clínicos incluem ≥10% perda de peso, comportamento, aparência física, ausência de resposta a estímulo). O teste de Fisher para proteção contra mortalidade e a análise Log-Rank de sobrevivência serão usados para calcular a significância das avaliações de vacinas experimentais. O poder estatístico foi calculado de acordo com o recomendado pelos 3Rs: http://hedwig.mgh.harvard.edu/sample_size/fisher/js/fisher.html. Resultados prévios de experimentos com vacinas de subunidade realizados pelos colaboradores brasileiros revelaram que a eficácia variou de 80-100%. Sendo assim, foi selecionada uma taxa de resposta de 0.8 como o limite mínimo para animais vacinados e 0.1 para o grupo controle. Potencia = 0.841. Com 10 animais no tratamento A (vacina) e 10 animais no tratamento B (controle), haverá uma chance de 84% de se detectar uma diferença significativa entre os grupos (>0.05). Para reduzir qualquer viés, animais serão randomicamente colocados em cada grupo. Os tratamentos serão aplicados em ordem aleatória, e os pesquisadores analisando os resultados não estarão cientes dos tratamentos.

Indicadores, Metas e Resultados

Os resultados previstos para esse projeto são:
1. Desenvolvimento de uma vacina efetiva contra Leptospirose humana.
2. Desenvolvimento de um diagnóstico otimizado para leptospirose
3. Estabelecimento de novas tecnologias para a identificação de novos candidatos vacinais utilizando Leptospira spp. adaptada ao hospedeiro.
4. Identificação de proteínas leptospirais verdadeiramente expostas na superfície utilizando novas técnicas.
5. Identificação de correlatos de imunidade que irão minimizar o uso de animais em estudos com novas vacinas.
6. Potencial aplicação dos candidatos vacinais para o controle de leptospirose animal.

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