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As doenças infecciosas provocadas por diferentes microrganismos, como bactérias, vírus, fungos e parasitas, constituem uma preocupação substancial para a saúde mundial [1]. Dentre os vários patógenos mencionados, as infecções fúngicas estão emergindo como uma grave ameaça à saúde pública [2]. A esporotricose, uma micose especialmente patogênica, causada pelo fungo dimórfico do gênero Sporothrix, é uma epidemia zoonótica que infecta humanos e animais, principalmente gatos e cães [3]. Este cenário é particularmente alarmante, especialmente com relação aos surtos epidêmicos de esporotricose no Brasil, que acontecem em diferentes regiões, incluindo o município de Pelotas e Rio Grande. Medicamentos antifúngicos, como anfotericina B (Anf B), itraconazol (ITZ), cetoconazol (CTZ) e iodeto de potássio estão entre as opções terapêuticas para o tratamento da esporotricose. No entanto, devido ao número limitado de antifúngicos disponíveis e a existência de muitos casos comprovadamente refratários, bem como a problemática da resistência ao ITZ [7] vê-se a necessidade de se monitorar tal resistência e buscar novas soluções terapêuticas. Em adição, vias alternativas de administração, como a aplicação intralesional e subcutânea também têm sido avaliadas como opções [8]. Dentre as formulações mais modernas disponíveis, os sistemas de nanoadministração têm recebido grande destaque na pesquisa científica. Porém, questões como dificuldades em superar barreiras físicas, especialmente a pele, acabam restringindo a capacidade de administração dos medicamentos de uma forma eficaz. Com o intuito de melhorar o transporte e entrega desses medicamentos, o encapsulamento em lipossomas elásticos surge como uma opção promissora. Os lipossomas elásticos, também denominados de transferossomas ou lipossomas deformáveis, são sistemas carreadores vesiculares ultradeformáveis [9] e surgiram como uma solução potencial para superar os desafios associados à administração transdérmica de diferentes fármacos [10]. Uma das principais características destes sistemas é a capacidade de se moldar e penetrar nos poros da pele sem induzir a liberação prematura do fármaco [11,12].
Nesse contexto, este projeto de pesquisa enfoca o desenvolvimento de formulações farmacêuticas de uso tópico, com características inovadoras, constituídos de lipossomas elásticos e potenciais antifúngicos para o tratamento dessa doença. Os sistemas serão avaliados quanto ao tamanho, carga superficial e elasticidade da bicamada. Em complementação a caracterização dos sistemas, serão realizados estudos físico-químicos detalhados a nível molecular a partir de diferentes técnicas instrumentais, como espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier com refletância total atenuada horizontal (HATR-FTIR), ressonância magnética nuclear (RMN) de fósforo (31P) e hidrogênio (1H) e calorimetria de varredura diferencial (DSC). Essas técnicas serão utilizadas para avaliar a relação entre as propriedades físico-químicas e a dinâmica de interação do antifúngico encapsulado nos parâmetros vibracionais, rotacionais e translacionais dos fosfolipídios estudados para uma melhor compreensão da dinâmica de interação e liberação.
As propriedades fungicidas desses carreadores serão avaliadas, a partir de ensaios in vitro, quanto ao uso promissor na terapia de felinos e caninos com esporotricose por fungos do complexo Sporothrix brasiliensis com sensibilidade e resistência aos medicamentos convencionais na medicina humana e medicina veterinária.
Por fim, a execução desta proposta não se limita somente ao preparo de formulações, mas realça o design cuidadoso de sistemas constituídos de nanomateriais a base de lipossomas elásticos, como alternativa ao tratamento de esporotricose, uma doença que se alastra no estado do Rio Grande do Sul, especialmente, nos municípios de Pelotas e Rio Grande. Esta, representa uma abordagem promissora e inovadora aos tratamentos convencionais, visando a potencialização do uso de medicamentos antifúngicos existentes e de novos princípios ativos com características antifúngicas que possam a ser encapsulados neste sistema. Essa abordagem visa integrar inovação tecnológica a necessidades locais de saúde, contribuindo para o avanço da ciência no Brasil.

4.1 Materiais – Todos os reagentes utilizados para o preparo dos lipossomas elásticos, bem como para os ensaios antifúngicos serão comprados com grau analítico de pureza.

4.2 Design e preparação de formulações lipossomas elásticos
1) Método de hidratação de vesículas: Em resumo, os lipídios, o surfactante e os antifúngicos serão dissolvidos em 2 mL de clorofórmio, em seguida este solvente orgânico será evaporado por pressão reduzida em rotaevaporador. Posteriormente, a formulação será submetida a hidratação com tampão fosfato pH 7,4. Os correspondentes lipossomas elásticos vazios serão preparados nas mesmas condições, omitindo o antifúngico, e serão utilizados como controles nas caracterizações físico-químicas e nos estudos antifúngicos e de biocompatibilidade in vitro. Todas as dispersões serão submetidas a sonicação por 3 minutos para diminuir o tamanho das vesículas e armazenadas a 4°C para posterior caracterização.
4.3 Caracterização físico-química dos lipossomas elásticos
As caracterizações físico-químicas e os ensaios antifúngicos (in vitro) serão realizadas na UFPel e na Universidade Federal do Rio Grande (FURG), conforme descrito a seguir:

4.3.1 Análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta
As análises do tamanho de partícula, PDI e potencial zeta serão realizadas baseadas no método de espalhamento dinâmico de luz (Dynamic Light Scattering) a 25ºC.
4.3.2 Eficiência de encapsulação
A percentagem do antifúngico encapsulado (EE%) nos lipossomas elásticos será determinada espectrometricamente por medidas UV-vis através do seu efluxo para o meio reacional após solubilização das membranas com excesso de surfactante. Experimentos controle (branco) serão realizados com lipossomas elásticos puros, na ausência dos antifúngicos. Com a finalidade de verificar a real quantidade de antifúngico adicionado nos lipossomas elásticos durante o seu preparo serão realizadas análises em amostras de lipossomas elásticos contendo antifúngico sem passar pelo processo de centrifugação.

4.3.3 Análise de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier com reflectância total atenuada (HATR-FTIR)
Os espectros de FTIR dos sistemas serão obtidos no modo HATR através do aparelho Shimadzu IR Prestige-21 (Kyoto, Japão). Nesta análise, 40 varreduras serão feitas à temperatura ambiente na faixa de frequência de 400 a 4000 nm, com resolução de 2 cm-1. Os espectros também serão analisados utilizando o software Shimadzu IR solution 1.5. Serão analisados os valores de frequência e alargamentos a 75% da altura dos picos referentes a estiramentos axiais de grupos lipídicos.

4.3.4 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
As medidas serão realizadas em aparelho Shimadzu DSC-60 (Quioto, Japão). A faixa de temperatura utilizada será de 25 ºC a 500 ºC, segundo a temperatura de transição de fase da fosfatidilcolina. A calibração do aparelho será realizada com o elemento índio. A taxa de aquecimento utilizada será de 5 °C min-1, sob fluxo de nitrogênio de 50/50 mL min-1.

4.3.5 Medidas de Ressonância Magnética de Fósforo (RMN de 31P)
As medidas de RMN de 31P dos lipossomas elásticos serão realizadas a 161 MHz, em equipamento de RMN Bruker 400 MHz (Ettlingen, Alemanha). As amostras serão analisadas em solvente H2O:D2O (80:20, v/v).

4.3.6 Medidas de Ressonância Magnética de Hidrogênio (RMN de 1H)
As medidas de RMN de 1H dos lipossomas elásticos serão realizadas a 400 MHz, em equipamento de RMN Bruker 400 MHz (Ettlingen, Alemanha). As amostras serão analisadas em solvente H2O:D2O (80:20, v/v). Para obtenção dos valores do T1 de 1H do grupo colina e metilênicos lipídicos, a sequência de pulsos de recuperação de inversão será utilizada.

4.4 Teste de suscetibilidade antifúngica
Serão utilizados isolados de Sporothrix spp. (incluindo Sporothrix schenckii e Sporothrix brasiliensis), obtidos de casos de esporotricose em felinos, caninos e humanos no Rio Grande do Sul, provenientes da micoteca do MicVet/UFPEL.
A atividade antifúngica do AMR contra Sporothrix spp. será avaliada pelo teste de concentração inibitória mínima (MIC). AMR serão preparados em soluções-estoque diluídas em DMSO. Nos ensaios de suscetibilidade, os fármacos serão diluídos em meio RPMI 1640 tamponado, em oito concentrações seriadas. Para garantir que o DMSO não interfira nos resultados, será avaliada sua maior concentração diluída em RPMI 1640 em microplacas de 96 poços, sem a adição dos fármacos. As microplacas serão incubadas a 37 °C por 72 horas, e a MIC será determinada visualmente pela comparação com o controle positivo.

4.5 Teste de citotoxicidade
As células da linhagem Derme Equina (ED) serão semeadas em microplacas de 96 poços, na densidade de 4 × 10⁴ células/poço, e mantidas a 37 °C em atmosfera úmida contendo 5% de CO₂. Em seguida, o meio de cultura será removido e as células expostas a concentrações seriadas dos fármacos testados, permanecendo incubadas por 24 horas nas mesmas condições. A integridade celular será verificada em microscópio invertido e, após a retirada dos tratamentos, a viabilidade será avaliada pelo ensaio colorimétrico de brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT). A partir desses resultados, será definida a maior concentração não tóxica de cada fármaco para os ensaios frente ao desafio com Sporothrix spp.

• Desenvolvimento e Caracterização de Formulações Transdérmicas de Lipossomas Elásticos para Uso Tópico com antifúngico: preparar e caracterizar lipossomas elásticos de fosfatifilcolina de soja, utilizando surfactantes para a encapsulação eficaz de antifúngicos. Meta: avaliar o tamanho, índice de polidispersão, estabilidade, elasticidade, capacidade de encapsulação, e liberação controlada dessas formulações.
• Avaliação da Atividade Antifúngica: realizar um conjunto abrangente de ensaios de suscetibilidade antifúngica para testar os compostos sintetizados contra isolados clínicos de Sporothrix spp. Meta: determinar a eficácia dos compostos em diferentes isolados, visando a aplicação clínica direcionada.
• Avaliação do Perfil de Citotoxicidade e Eficácia Terapêutica: medir a citotoxicidade das formulações em culturas celulares relevantes, assim como a eficácia antifúngica. Meta: estabelecer a margem de segurança para uso potencial em terapias antifúngicas.
• Publicação dos resultados e capacitação de pesquisadores: As descobertas sobre as formulações antifúngicas desenvolvidas serão publicadas em revistas de alto impacto. Também serão depositadas patentes a partir dos resultados obtidos. Metas: Divulgar e ampliar o conhecimento e o corpo acadêmico na área de desenvolvimento de formulações transdérmicas antifúngicas, utilizando os dados encontrados no presente projeto. Capacitar alunos de pós-graduação e graduação na pesquisa e desenvolvimento de novas formulações.