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Acinetobacter baumannii é uma bactéria Gram-negativa aeróbica, catalase-positiva, não móvel e não fermentadora, com morfologia típica de cocobacilos (PELEG, SEIFERT & PATERSON, 2008; MARTINS & BARTH, 2013). Naturalmente encontrada no trato gastrointestinal humano, A. baumannii é considerado um patógeno oportunista, sendo comumente associado com a ocorrência de surtos de infecções em ambientes hospitalares (LI et al., 2016). Dentre as complicações geradas pela infecção por esse microrganismo, estão: bacteremia, septicemia, meningites, infecções do trato respiratório e urinário e infecções em feridas e tecidos moles (BOLOURCHI et al., 2019).

Apesar de possuir baixa incidência global quando comparado a outros patógenos Gram-negativos, A. baumannii gera grandes preocupações acerca de sua elevada capacidade de aquisição de mecanismos de resistência às mais diversas classes de antimicrobianos (MARTINS & BARTH, 2013; CHEN et al., 2014; HARDING, HENNON & FELDMAN, 2017). Cepas A. baumannii multidroga-resistentes (MDR) estão surgindo constantemente, dificultando o manejo de pacientes hospitalizados em função da ausência de antibióticos eficazes e disponíveis no mercado (BOLOURCHI et al., 2019). Infecções causadas por A. baumannii geralmente estão associadas a quadros clínicos com tempo prolongado de hospitalização, custos elevados para a saúde pública e altas taxas de mortalidade, apesar da aplicação de medidas terapêuticas (ZHANG et al., 2016).

A patogenicidade de A. baumannii está relacionada com a presença de diversos fatores de virulência, como componentes de superfície celular, resistência ao soro e formação de biofilmes (BOLOURCHI et al., 2019). Isolados de A. baumannii são capazes de persistir por longos períodos sobre superfícies abióticas, apresentando elevada capacidade de resistência a processos dessecativos e ação de moléculas antimicrobianas (MARTINS & BARTH, 2013; HARDING, HENNON & FELDMAN, 2017). Isolados produtores de biofilme são favorecidos pelo aumento da capacidade de colonizar equipamentos e materiais médico-hospitalares, bem como, dificultam sua completa eliminação do ambiente (BABAPOUR et al., 2016). No hospedeiro, possui capacidade de evadir o sistema imunológico inato para estabelecer a infecção, tornando esse patógeno capaz de desenvolver quadros infeciosos graves (NIELSEN et al., 2017). Porinas, polissacarídeos capsulares, lipopolissacarídeos (LPS), fosfolipases, vesículas de membrana externa (Outer membrane vesicles – OMV), sistemas de aquisição de metais, sistemas de secreção de proteínas, proteínas de ligação a penicilina e moléculas de adesão (fímbrias) são descritos como os principais mecanismos moleculares associados a virulência de A. baumannii (MARTINS & BARTH, 2013; LEE et al., 2017).

O desenvolvimento de terapias baseadas em imunização passiva, utilizando anticorpos específicos, é uma abordagem promissora para o controle dessas infecções, apresentando elevado potencial para prevenir surtos, melhorar quadros clínicos de pacientes hospitalizados e contornar a ausência de antimicrobianos disponíveis em função da multi-resistência (LUO et al., 2012). Diversos antígenos já foram preditos através de análises in silico, sendo alguns deles já avaliados em ensaios in vitro e in vivo, apresentando-se como importantes alvos a serem estudados para o desenvolvimento de imunoterapias. Dentre os alvos antigênicos promissores, proteínas fimbriais e adesinas são moléculas preditas como alvos extracelulares relacionadas com os processos de adesão e início da colonização, bem como, estão associadas a formação de biofilmes bacterianos (ABRAHAM et al., 2015). Sendo assim, alternativas terapêuticas baseadas em anticorpos que bloqueiem de alguma forma estes processos, são altamente promissoras para impedir, reduzir e controlar o desenvolvimento de infecções causadas por A. baumannii.

CAM87009.1 é predita como uma proteína hipotética fimbrial do tipo adesina de, aproximadamente, 34 kDa, conservada dentro da espécie A. baumannii. Além disso, apresenta elevado potencial de adesão e não apresenta homologia com proteínas humanas (NI et al., 2017). Apesar destas características relevantes, CAM87009.1 ainda não foi avaliada quanto às suas propriedades antigênicas e imunogênicas in vitro e in vivo, reforçando a utilização dela nesta proposta.

FilF foi predita como uma proteína fimbrial de, aproximadamente, 68 kDa, localizada na membrana externa, com elevado potencial de aderência e imunogenicidade e com epítopos conservados em genomas de diferentes cepas de Acinetobacter baumannii (SINGH et al., 2016, NI et al., 2017). Singh et al. (2016) demonstraram o potencial imunoprotetor de FilF em modelos murinos com pneumonia induzida pela infecção experimental com A. baumannii ATCC 19606. Entretanto, apesar dos resultados promissores, o potencial imunoprotetor dessa proteína ainda não foi bem elucidado, uma vez que sua ação protetora ainda não foi verificada em cepas A. baumannii multidroga-resistentes. Adicionalmente, FilF é predita como um fator de virulência associado à formação de biofilme (LI et al., 2015). Um estudo realizado por Marti et al (2011), identificou FilF como uma proteína de Pili tipo III, superexpressa em um isolado A. baumannii formador de biofilme. Sendo assim, também se apresenta como um alvo importante a ser estudado. Diante do exposto, o presente projeto prevê a produção destas duas proteínas na forma recombinante, utilizando sistema heterólogo procarioto, e a utilização delas como alvos no desenvolvimento de um produto imunoterápico para o tratamento de infecções causadas por A. baumannii.

3.1. Cepas, isolados bacterianos e condições de cultivo
Uma cepa Escherichia coli BL21 Star (D3) será utilizada neste estudo como maquinaria celular heteróloga na produção das proteínas recombinantes. A cepa será estocada à -20 °C em caldo Brain Heart Infusion (BHI) acrescido de 10% glicerol (v/v). O cultivo será realizado à 37 °C em caldo Luria-Bertani (1% de triptona, 0,5% de extrato de levedura e 0,5% de NaCl) e ágar Luria-Bertani (adição de ágar 2%), com adição de 100 µg/mL de ampicilina, quando necessário.
Dez isolados clínicos de A. baumannii obtidos de paciente internados em hospital da cidade de Pelotas, Rs, Brasil, serão utilizados nos experimentos. Os isolados serão doados pelo Hospital Escola (HE) da Universidade Federal de Pelotas previamente identificados pelo sistema automatizado VITEK 2® GN (bioMérieux, France). Análises fenotípicas (antibiograma, Teste de Hodge Modificado e de formação de biofilme) e moleculares (PCR e PFGE) serão utilizados para caraterização dos isolados.

3.2. Modelo animal

Seis camundongos fêmeas BALB/C com 6 - 8 semanas de idade serão utilizadas neste estudo. Os animais serão mantidos em caixas de polipropileno próprias no Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), sendo alocados dois animais por caixa e os mesmos alimentados com ração e água ad libitum. Todos os experimentos serão conduzidos conforme as regulamentações, princípios e políticas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas.

3.1. Construção dos primers
As sequências de aminoácidos das proteínas FilF e CAM87009.1 serão obtidas através do banco de dados NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e analisadas através do software Vector NTI para o desenho dos primers. Sequências correspondentes ao peptídeo sinal serão identificadas através do software online SignalP-5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) e removidas. Os primers serão desenhados para flanquear as regiões de 1027pb e 1926pb correspondente as sequências de CAM87009.1 e FilF, respectivamente. Sequências nucleotídicas correspondentes aos sítios de restrição de enzimas (BamHI, PstI e EcoRI) serão adicionadas às extremidades dos primers para posterior clonagem em vetor plasmidial pAE.

3.2. Clonagem, expressão e purificação das proteínas recombinantes
Os genes FilF e CAM87009.1 serão amplificados através da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando DNA genômico de Acinetobacter baumannii ATCC 19606 e os primers correspondentes. Os genes serão clonados em vetor pAE através da digestão com enzimas de restrição (BamHI, PstI e EcoRI) e ligação com DNA ligase T4. Os plasmídeos pAE contendo os genes codificantes serão utilizados para transformar uma cepa E. coli BL21 Star (DE3) por eletroporação. O cultivo transformado será plaqueado em meio ágar Luria Bertani (LB) contendo 100 µg/mL de ampicilina para triagem dos clones recombinantes. Após seleção de uma colônia recombinante, será feito um inóculo em 500 mL de caldo LB até atingir DO600 = 0,8 sob agitação de 130 rpm à 37 °C. Ao atingir a densidade óptica adequada, a expressão será induzida por 4h através da adição de 0,5 mM de isopropil-β-1-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) ao cultivo. As células serão separadas por centrifugação (7.000 x g, 4 °C, 15 min) e suspendidas em tampão de lise contendo 1 mg/mL de lisozima. As células serão sonicadas, centrifugadas e alíquotas do pellet e do sobrenadante serão avaliadas para determinar a presença das proteínas recombinantes em sua forma solúvel ou insolúvel, aplicando protocolo específico para recuperação das proteínas. As proteínas serão purificadas através de cromatografia de afinidade utilizando colunas HisTrap carregadas com níquel e a quantificação das proteínas será feita através de kit BCA Protein Assay (Pierce, USA). A detecção das proteínas recombinantes será avaliada através das técnicas de Western blotting e ELISA a partir da utilização de anticorpos anti-6Xhistidine conjugados a peroxidase.

3.3. Detecção de rFilF e rCAM87009.1 por soro de humanos naturalmente infectados por A. baumannii
Soros humanos provenientes de pacientes com infecção nosocomial causada por A. baumannii, serão coletados e doados pelo Hospital Escola (HE) da Universidade Federal de Pelotas para a realização destes experimentos. Ensaios do tipo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e WB (Western Blotting) serão utilizados para avaliar a reação dos soros com as proteínas recombinantes. Para o ensaio de ELISA, placas de poliestireno com 96 cavidade serão sensibilizadas com os antígenos recombinantes diluídos em tampão carbonato-bicarbonato (50mM pH 9,6). A concentração de cada um dos antígenos, bem como a diluição dos soros serão pré-determinadas através de ELISA checkerboard. Após incubação por 1h à 37°C, as cavidades serão lavadas com tampão fosfato salino (PBS 1X) e bloqueadas com solução de caseína 0,5%. Um pool de soros positivos será diluído em PBS 1X e mantido em contato com os antígenos por 1h à 37°C. Um pool de soros negativos para A. baumannii será utilizado como controle negativo para o teste. Anticorpos anti-IgG humanos conjugados a peroxidase serão adicionados em diluições pré-estabelecidas pelo fabricante. As placas de poliestireno serão mantidas á 37°C por 1h entre cada uma das etapas do teste. Além disso, entre cada uma das etapas, as placas serão lavadas três vezes com solução PBS-T (PBS + 0,05% Tween 20). A visualização do teste será feita através da adição de tampão citrato 0,1 M acrescido de 0,2 mg/mL de o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD) e 0,03% de H2O2. Uma solução 2M H2SO4 será utilizada para parar a reação. A quantificação da reação será realizada em espectrofotômetro com comprimento de onda de 492nm.
Para o ensaio de WB, os antígenos recombinantes serão separados em SDS-PAGE 10%. A concentração de antígenos utilizada será definida em ensaios prévios de padronização. Após eletroforese, as proteínas serão eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose (overnight à 30V). As membranas serão bloqueadas com soro fetal bovino 1% (SFB) por 1h sob agitação (50rpm), lavadas com PBS-T e os pools positivos e negativos serão adicionados em diluições pré-estabelecidas. Após 1h de agitação, os soros serão removidos, as membranas lavadas com PBS-T e os anticorpos conjugados anti-IgG humanos serão adicionados nas concentrações definidas pelo fabricante. A revelação será feita através da adição de solução substrato/cromógeno (6mg de diaminobenzidina, 0,03% de sulfato de níquel, 50 mM de Tris HCl pH 8,0 e 0,03% de peróxido de hidrogênio) para a visualização das bandas correspondentes às proteínas.

3.4. Produção, titulação e isotipagem de anticorpos policlonais anti-rFilF e anti-rCAM87009.1
A produção de anticorpos policlonais (pAbs) em camundongos será realizada conforme descrito por McConnell et al. (2006), com adaptações. Os antígenos recombinantes terão suas concentrações ajustadas à 0,4 mg/mL através de diluição em solução estéril de PBS 1X. As administrações nos animais serão realizadas pela via subcutânea nos dias 0, 14 e 21 e os antígenos serão administrados separadamente, sendo os animais divididos em três grupos de dois animais cada: grupo 1 (FilF + adjuvante), grupo 2 (CAM87009.1 + adjuvante) e grupo 3 (PBS 1X). A primeira dose (dia 0) será composta de 100 µL do antígeno acrescido do Adjuvante Completo de Freund, na proporção de 1:1 (20 µg de antígeno por aplicação). As doses subsequentes (dias 14 e 21) serão compostas de Adjuvante Incompleto de Freund, nas mesmas diluições e metodologias de imunização. O sangue dos animais será coletado nos dias 7, 18 e 25 para separação do soro. O soro será obtido através da incubação do sangue à 37 °C por 30 min, seguido de centrifugação (5000 x g 7 min) e coleta do sobrenadante. Os títulos de anticorpos serão obtidos através de ensaio de ELISA, como descrito anteriormente. A titulação dos soros será através da metodologia de diluição seriada de base dois. Os isotipos IgM e IgG e suas subclasses serão avaliados através da aplicação do ensaio ELISA indireto.

3.5. Ensaios de fagocitose dependente de anticorpo (opsonização)
O ensaio de fagocitose será conduzido como descrito por Luo et al (2012), com algumas modificações. Isolados A. baumannii serão cultivados em caldo BHI overnight à 37°C, lavados, quantificados e adicionados em placas de 96 cavidades. Soros imunes e não imunes serão adicionados em diferentes concentrações (10, 20, 30, 40 e 50%) e mantidos por 1 h. Macrófagos murinos RAW 264.7 (American Type Culture Collection) serão previamente cultivados (37°C, 5% CO2 ) em meio RPMI 1640 acrescido de 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina, estreptomicina e glutamina e 50µM de β-mercaptoetanol. As células serão ativadas através da exposição à 100nM de PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) durante um período de três dias. Macrófagos ativados serão adicionados as cavidades em proporções de 1:5, 1:10 e 1:20 (bactérias por macrófagos). Após 1 h de incubação com leve agitação, os conteúdos das cavidades serão removidos e plaqueados em meio ágar BHI para contagem de UFC (Unidades Formadoras de Colônias). Os resultados serão expressos conforme a porcentagem de células bacterianas viáveis em comparação com a média do grupo controle (soro não-imune).

 
3.6. Ensaio de inibição de biofilme
O efeito dos pAbs em relação a formação de biofilme será avaliado através de metodologia descrita por She et al (2016) com algumas adaptações. Placas de poliestireno de 96 cavidades serão preenchidas com 200µL de cultivo prévio diluído em caldo LB sem a adição de NaCl (diluição de 2:100 em caldo LB) acrescido de soros imunes e não imunes nas diluições 1:50, 1:100 e 1:200. Um cultivo sem a presença de soros será utilizado como controle do experimento. Após 24h de cultivo à 37 °C, 200µL de solução cristal violeta 0,5% será adicionada por 15 min para corar a massa total de biofilme formada. Após esse período, as cavidades serão lavadas com água

A descoberta de novos agentes antibacterianos, bem como, o desenvolvimento de novas moléculas que controlem infecções causadas por patógenos como A. baumannii, tem estimulado diversos estudos nos últimos anos. Isto se deve, principalmente, ao crescente número de isolados caracterizados como altamente resistentes às mais diversas classes de antimicrobianos disponíveis e com isso, a falta de estratégias terapêuticas eficientes. O presente estudo, visa colaborar nestas linhas de pesquisa, buscando pelo desenvolvimento de um produto biotecnológico eficaz no tratamento dessas infecções. Sendo assim, acredita-se ser possível uma terapia a base da utilização de anticorpos policlonais específicos contra algumas proteínas extracelulares de A. baumannii como, por exemplo, a FilF e CAM87009.1. A escolha destes alvos baseia-se na localização dos mesmos, uma vez que são proteínas presentes em um anexo bacteriano (fímbrias) altamente relacionado com a adesão do patógeno aos tecidos do hospedeiro, processo este que desencadeia a colonização bacteriana e desenvolvimento do processo infeccioso. Adicionalmente, proteínas fimbriais podem estar envolvidas no processo de formação de biofilme, estrutura que auxilia na manutenção da viabilidade de células bacterianas, dificultando a ação de fármacos e a eliminação desses patógenos.
A estratégia deste trabalho baseia-se na obtenção desses antígenos de forma recombinante em sistema procarioto E. coli, uma vez que esta metodologia já é muito bem estabelecida. Acredita-se que esses antígenos recombinantes sejam capazes de induzir uma resposta imune significativa, de forma a ser possível a obtenção de soro contendo anticorpos policlonais em títulos elevados. Além disso, estima-se que esses antígenos recombinantes apresentem-se com estrutura e propriedade antigênica semelhante ao que ocorre in vivo. A hipótese do estudo baseia-se na atividade desses anticorpos em inibirem a formação de biofilme em isolados A. baumannii, de forma a demonstrar sua aplicação em diversos segmentos hospitalares. Além disso, estima-se que os policlonais tenham capacidade de inibir a adesão do patógeno às células epiteliais, demonstrando a importância dessas proteínas no processo de colonização bacteriana, bem como a funcionalidade do produto para fins terapêuticos.