Nome do Projeto
Papel protetor do ácido tânico sobre alterações bioquímicas observadas na hipermetioninemia: estudos in vivo
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/07/2020 - 31/07/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Diversos estudos têm demonstrado que a hipermetioninemia que é caracterizada por elevadas concentrações teciduais e plasmáticas do aminoácido metionina (Met) e de seus metabólitos, como a metionina sulfóxido (MetO), pode ser uma condição extremamente danosa a diversos tecidos. Nesta patologia, a concentração plasmática de Met pode atingir até 2500 μmol/L, sendo que os valores normais estão em torno de 30 μmol/L. Um número considerável de pacientes hipermetioninêmicos podem apresentar importantes alterações neurológicas como déficit cognitivo, edema e desmielinização cerebral, bem como dano hepático cuja fisiopatologia não está completamente estabelecida. Além disso, o tratamento para hipermetioninemia é muito restrito, baseando-se em dieta isenta de Met e suplementação de S-adenosilmetionina, produto essencial proveniente da metabolização da Met. Sendo assim, se torna extremamente importante a busca por novas abordagens terapêuticas para a hipermetioninemia com o intuito de minimizar os sintomas e melhorar a qualidade de vida dos seus portadores. Nesse sentido, compostos isolados de produtos naturais possuem um potencial terapêutico promissor e de grande interesse no tratamento da patologia alvo deste estudo, uma vez que podem atuar na prevenção/reversão das alterações sistêmicas encontradas nessa doença. Nesse contexto, destaca-se o ácido tânico, um polifenol que possui uma extensa atividade antioxidante e neuroprotetora evidenciada na literatura. Desta forma, no presente estudo pretende-se avaliar o efeito protetor desse produto natural frente a alterações bioquímicas encontradas na hipermetioninemia aguda e crônica

Objetivo Geral

Avaliar o efeito in vivo do tratamento com ácido tânico (AT) sobre alterações bioquímicas encontradas em modelo animal de hipermetioninemia aguda e crônica.

Justificativa

A hipermetioninemia ocorre em várias desordens metabólicas, dentre elas, na deficiência da enzima metionina adenosiltransferase. Essa doença é bioquimicamente caracterizada por altos níveis de Met, bem como de seus metabólitos, como a metionina sulfóxido MetO e metanotiol. Pacientes hipermetioninêmicos podem apresentar alterações neurológicas, como déficit cognitivo, edema, hepáticas e inflamatórias que ainda não estão completamente elucidadas. O nosso grupo de pesquisa tem realizado diversos estudos utilizando modelos in vitro e in vivo de hipermetioninemia com o intuito de auxiliar na compreensão dos mecanismos fisiopatológicos dessa desordem. Em encéfalo, já foi relatado que elevadas concentrações de Met podem alterar a atividade de enzimas antioxidantes, da acetilcolinesterase (AChE), Na+,K+-ATPase, induzir peroxidação lipídica, e reduzir o conteúdo de importantes lipídios de membrana (gangliosídeos, fosfolipídios e colesterol), além de causar déficit de memória em ratos (Stefanello et al., 2007b; Stefanello et al., 2007c). Costa e colaboradores (2013) demonstraram em um estudo in vitro e in vivo (agudo de 1 e 3 h) que elevadas concentrações de Met e MetO são capazes de induzir dano oxidativo em fígado de ratos. Além disso, Soares et al. (2017) demonstraram que a administração crônica de Met, MetO e a associação de Met e MetO é capaz de alterar parâmetros de estresse oxidativo como ERO, tióis, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), e atividade da SOD, CAT, GPx e ALA-D em fígado e rim de ratos jovens. Além disso, a toxicidade de Met e MetO foi investigada em cultivo primário de macrófagos e foi observado que esses aminoácidos induzem a polarização M1 dessas células, além de modular parâmetros de estresse oxidativo e do sistema purinérgico (Dos Santos et al., 2016). Ademais, diversas alterações neuroquímicas e comportamentais já foram descritas em modelos de hipermetioninemia. Já foi observado que Met e/ou MetO causam um desbalanço no status redox, alteram a atividade das enzimas acetilcolinesterase e Na+ ,K+ -ATPase e causam morte celular por apoptose em cérebro de ratos (Soares et al., 2018). Embora importantes danos tenham sido revelados nos modelos biológicos de hipermetioninemia, os exatos mecanismos que levam a essas alterações ainda continuam pouco esclarecidos. Além disso, considerando que o tratamento para hipermetioninemia é bastante limitado, se torna de extrema relevância a busca por novas alternativas terapêuticas capazes de minimizar os sintomas e melhorar a qualidade de vida dos seus portadores.
Concomitante a isso, nosso grupo de pesquisa possui um crescente interesse na utilização de produtos naturais e seus derivados (Oliveira et al., 2017, 2018; Pacheco et al., 2018; Spohr et al., 2019; Debom el al., 2016; Cardoso et al., 2018; Pedra et al., 2018), em função da grande quantidade de fármacos oriundos de produtos naturais e do considerável potencial terapêutico. Nesse contexto, o AT se destaca por apresentar uma extensa atividade farmacológica relatada na literatura, além de não apresentar toxicidade em baixas concentrações. Sabe- se que o AT é um composto polifenólico de origem vegetal, podendo ser encontrado em diversos alimentos, como uvas, bananas e lentilhas, e em diversas bebidas como chá preto, chá verde, cerveja e vinho tinto (King et al., 1999). De maneira similar a outros polifenois, o AT foi capaz de demonstrar atividade antimicrobiana (Dong et al., 2018; Hancock et al., 2010), antitumoral (Naus et al., 2007; Darvin et al., 2017; Bona et al., 2019), mas principalmente atividade antioxidante (Gülçin et al 2010; Muccilli et al., 2017; Basu et al., 2018) e neuroprotetora (Lu et al., 2006; Ashafaq et al., 2016; Gerzson et al., 2019). Nesse sentido, considerando que diversos achados utilizando modelos experimentais de hipermetioninemia, especialmente quanto ao possível envolvimento do estresse oxidativo na patofisiologia desta desordem, já foram descritos pelo nosso grupo de pesquisa, associado aos evidentes efeitos dos produtos naturais e seus derivados na prevenção e tratamento de diversas patologias, especialmente quanto aos seus efeitos antioxidante e anti-inflamatório, no presente estudo pretende-se avaliar o efeito protetor do AT frente a alterações bioquímicas encontradas na hipermetioninemia aguda e crônica.

Metodologia

- Animais e aspectos éticos
Todos os procedimentos experimentais envolvendo os animais proposto neste projeto foram aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas – UFPel (38255-2019). Os animais serão provenientes do Biotério central da UFPel onde serão mantidos em ambiente com temperatura (20 –24ºC) e umidade (40 – 60%) controladas, água e alimento ad libitum, e ciclos claro-escuro de 12 horas.

- Protocolo experimental agudo
Serão utilizados ratos Wistar machos (29 dias), os quais serão divididos em seis grupos experimentais como demonstrado abaixo:

Tabela 1: Protocolo agudo de 1 h
Grupos Tratamento
I Controle
II Ácido Tânico 30 mg/kg
III Ácido Tânico 60 mg/kg
IV Met 0,4 g/Kg + MetO 0,1 g/Kg
V Met 0,4 g/Kg + MetO 0,1 g/Kg + Ácido Tânico 30 mg/kg
VI Met 0,4 g/Kg + MetO 0,1 g/Kg + Ácido Tânico 60 mg/kg

Tabela 2: Protocolo agudo de 3 h
Grupos Tratamento
I Controle
II Ácido Tânico 30 mg/kg
III Ácido Tânico 60 mg/kg
IV Met 0,4 g/Kg + MetO 0,1 g/Kg
V Met 0,4 g/Kg + MetO 0,1 g/Kg + Ácido Tânico 30 mg/kg
VI Met 0,4 g/Kg + MetO 0,1 g/Kg + Ácido Tânico 60 mg/kg

Os animais serão pré-tratados com AT nas doses de 30 e 60 mg/kg durante sete dias por via oral. O composto será preparado todos os dias e diluído em água. No oitavo dia após o pré-tratamento os ratos dos grupos IV, V e VI receberão uma injeção subcutânea de Met + MetO enquanto que o grupo I, II e III receberão o volume equivalente de solução salina. Após 1 h ou 3 h da administração dos aminoácidos, os animais serão submetidos a eutanásia e o soro, as plaquetas, os linfócitos, o encéfalo o fígado e rim serão coletados para as posteriores análises bioquímicas.

- Protocolo experimental crônico
Serão utilizados ratos Wistar (6 dias) machos e fêmeas, os quais serão divididos em quatro grupos:

Tabela 3: Protocolo crônico de hipermetioninemia e tratamento com ácido tânico por 7 dias.
Grupos Tratamento
I Controle
II Ácido Tânico 30 mg/kg
III Ácido Tânico 60 mg/kg
IV Met 0,2 g/Kg + MetO 0,05 g/Kg
V Met 0,3 g/Kg + MetO 0,075 g/Kg + Ácido Tânico 30 mg/kg
VI Met 0,4 g/Kg + MetO 0,1 g/Kg + Ácido Tânico 60 mg/kg

Tabela 4: Protocolo crônico de hipermetioninemia e tratamento com ácido tânico por 32 dias.
Grupos Tratamento
I Controle
II Ácido Tânico 30 mg/kg
III Ácido Tânico 60 mg/kg
IV Met 0,2 g/Kg + MetO 0,05 g/Kg
V Met 0,3 g/Kg + MetO 0,075 g/Kg + Ácido Tânico 30 mg/kg
VI Met 0,4 g/Kg + MetO 0,1 g/Kg + Ácido Tânico 60 mg/kg

No tratamento crônico de hipermetioninemia, a solução de Met+MetO será administrada aos animais do 6° ao 28° dia de vida, por via subcutânea, duas vezes ao dia e com intervalo de 8 h entre as injeções. Durante os primeiros 8 dias de tratamento, os ratos receberão 0,2 g/Kg de peso corporal de metionina e metionina sulfóxido 0,05 g/Kg, do 14° ao 20° dia de vida os ratos receberão metionina 0,3 g/Kg de peso corporal e 0,075 g/Kg de MetO, do 21° ao 28° dia de vida os ratos receberão 0,4 g/Kg de metionina e 0,1 g/Kg de MetO (Stefanello et al., 2007a). Após 12 horas da última injeção, no 29° dia de vida dos animais, o tratamento com AT nas doses de 30 e 60 mg/kg será iniciado por via oral, uma vez ao dia durante. Metade dos animais serão tratados com AT durante 7 dias (até o 35° dia de vida) e a outra metade receberá AT durante 32 dias, até atingirem a fase adulta (60 dias de vida). Após os tempos de tratamento, os animais serão submetidos a eutanásia e o soro, as plaquetas, os linfócitos, o encéfalo o fígado e rim serão coletados para as posteriores análises bioquímicas.

- Análises bioquímicas
Após a eutanásia dos animais serão coletados o soro, o fígado, o rim e o cérebro, onde todas as amostras ficarão armazenadas em freezer -80°C. Em tempo adequado, os tecidos armazenados serão homogeneizados para a realização dos ensaios, onde serão feitas as seguintes análises:

a) Parâmetros de estresse oxidativo
- Determinação de espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS): Será realizada pelo método de Esterbauer e Cheeseman (1990). A absorbância será mensurada a 530 nm. Os resultados serão expressos em nmol TBARS/mg de proteína.
- Medida do conteúdo tiólico total: Será realizada pelo método de Aksenov e Markesbery (2001). Os resultados serão expressos em nmol TNB/mg de proteína.
- Determinação da atividade da catalase (CAT): Será determinada de acordo com o método descrito por Aebi (1984), baseado na decomposição da H2O2, acompanhada a 240 nm, à temperatura ambiente.
- Determinação da atividade da glutationa peroxidase (GPx): O método será conforme descrito por Habig e colaboradores (1974) e baseia-se na oxidação do NADPH acompanhada a 340 nm a 37ºC. A atividade da GPx será calculada pela velocidade da oxidação de NADPH.
- Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD): O método utilizado será conforme descrito por Spitz e Oberley (1989). Uma unidade de atividade de SOD é definida como a quantidade necessária para reduzir a velocidade da reação em 50%.
- Produção de espécies reativas de oxigênio (ERO): A detecção de ERO será realizada através da oxidação da 2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato (Ali et al., 1992). Os resultados expressos em µmol DCF/mg de proteína.
- Quantificação dos níveis de nitritos: Serão utilizados 100 µL do tecido no qual será adicionado 100 µL da solução de sulfanilamida em 5% de ácido fosfórico, incubando-se durante 10 minutos em temperatura ambiente e protegido da luz. Após, serão acrescentados 100 µL da solução de N-(1-naftil)etilenodiamina (NED) a 0,1%, incubando-se novamente por 10 minutos em temperatura ambiente e protegido da luz. A absorbância será determinada em 540 nm (Huang et al., 2009). Os resultados serão expressos em μM nitrito/mg de proteína.
- Atividade da glutationa S-transferase (GST): A atividade da GST será medida utilizando 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) como substrato de acordo com o método de Habig et al. (1974). A atividade será expressa como µmol GS-DNB/min/mg de proteína.

b) Determinação da atividade da AChE
Esse método é baseado na formação do ânion amarelo 5-tio-2-nitrobenzoato que pode ser determinado a 412 nm, monitorando-se por 2 minutos a cada 30 segundos a 25°C. A atividade da enzima será expressa em μmol AcSCh/hora/mg de proteína (Ellman et al., 1961).

c) Determinação da atividade da Na+K+-ATPase
Neste ensaio será utilizado um meio de incubação contendo 5,0 mM de MgCl2, 80,0 mM de NaCl, 20,0 mM de KCl e 40,0 mM de Tris-HCl, pH 7,4. A reação será iniciada após a adição de ATP a uma concentração final de 3,0 mM. Os controles serão realizados sob as mesmas condições com a adição de 1,0 mM de ouabaína. A atividade de Na+, K+-ATPase será calculada pela diferença entre os dois ensaios, conforme descrito por Carvalho et al., (2015) e o fosfato inorgânico (Pi) liberado foi medido pelo método de Chan et al., (1986). A atividade específica da enzima será expressa em nmol Pi/min/ mg de proteína.

d) Parâmetros bioquímicos séricos

- Preparação dos linfócitos
Os linfócitos serão isolados do sangue periférico coletado com EDTA e separados sob um gradiente de densidade com Ficoll-Hypaque como descrito por Böyum (1968). A viabilidade celular destes linfócitos será estimada através da enzima lactato desidrogenase (LDH) citosólica presente na amostra antes e depois da incubação a 37°C e comparada com a atividade total da enzima em células lisadas com 0,1% Triton X-100 e pela coloração com o corante vital Azul de Tripan.

- Preparação das plaquetas
Para a preparação de plasma rico em plaquetas (PRP), o sangue total será coletado com citrato de sódio, como descrito anteriormente por Lunkes et al. 2004. O sangue total será centrifugado a 160 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, o PRP será centrifugado a 1400 x g durante 30 min e lavado duas vezes com tampão HEPES 3,5 mM, pH 7,0; PRP será então ressuspendido em 200 μL de tampão HEPES para posterior análise.

- Preparação do soro
Amostras de sangue serão coletadas em tubos sem anticoagulante, centrifugadas a 3500 rpm por 15 min para a obtenção do soro.

- Atividade da NTPDase, 5'-nucleotidase e ADA em plaquetas, linfócitos e soro
A atividade enzimática da NTPDase e da 5′-nucleotidase será realizada conforme descrito por Pilla et al. (1996), Leal et al. (2005) e Lunkes et al. (2004). Para determinar a atividade da NTPDase, as amostras serão pré-incubadas por 10 min a 37°C em meio de reação contendo 5 mM de CaCl2, 100 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 6 mM de glicose e 50 mM de tampão Tris-HCl pH 7,4. Para a atividade da 5'-nucleotidase, substituiu-se CaCl2 5 mM por MgCl2 10 mM no meio de reação mencionado acima. A reação será iniciada após a adição de ATP ou ADP na concentração final de 1 mM e AMP a uma concentração final de 2 mM. Após 60 min de incubação, os ensaios enzimáticos serão interrompidos pela adição de TCA a 10%. O Pi será quantificado pelo método de Chan et al (1986). Atividades específicas serão relatadas como nmol Pi/min/mg de proteína.
A atividade da ADA será medida pelo método de Giusti & Galanti (1984). Para esse ensaio, as amostras serão submetidas à reação com 21 mmol/L de adenosina, pH 6,5, e incubadas a 37°C por 60 min. A amônia formada, reagirá com hipoclorito e fenol de nitroprussiato gerando o indofenol. A atividade específica da ADA será expressa em unidades por mg de proteína.

- Análise estatística
Para a realização da análise estatística será utilizado o software GraphPad PRISM 5. Os resultados serão expressos como média ± desvio padrão e analisados por Análise da Variância (ANOVA) de uma via seguidos de post hoc de Tukey. O nível mínimo de significância aceito será de p<0,05.

Indicadores, Metas e Resultados

Sabe-se que os EIM são doenças hereditárias, a maioria autossômica recessiva, que se caracterizam pela deficiência em uma proteína, normalmente uma enzima. Essa deficiência pode ser parcial ou total, como consequência disso ocorre o acúmulo de substratos e seus derivados, muitas vezes tóxicos, sendo determinantes na identificação das rotas metabólicas afetadas. Os EIM, de maneira geral, são distúrbios graves que se manifestam na infância e cujo diagnóstico pode ser dificultado devido ao grande número de alterações, diversidade de efeitos metabólicos e ausência, na maioria dos casos, de sinais e sintomas específicos. Assim, a maioria dos EIM pode beneficiar-se de um tratamento específico, que será melhor quanto mais precoce for o diagnóstico. Apesar de raros quando considerados isoladamente, em conjunto os EIM são frequentes, afetando um em cada mil recém-nascidos vivos, e representam 20% das mortes por doenças genéticas.
Considerando o exposto, estudos relacionados a prevenção e/ou reversão de alterações bioquímicas presentes na hipermetioninemia, erro inato alvo de nosso grupo de pesquisa, são extremamente relevantes para o estabelecimento de terapias mais efetivas aos pacientes afetados.
Convém ressaltar ainda alguns pontos importantes como a contribuição para o conhecimento científico em termos de doenças metabólicas, ampliação de pesquisa na área temática proposta com consequente geração de novos resultados que serão divulgados em congressos e artigos científicos; e formação de recursos humanos.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
BERNARDO DE MORAES MEINE
FRANCIELI MORO STEFANELLO2
JULIANE DE SOUZA CARDOSO
MAYARA SANDRIELLY PEREIRA SOARES2
ROSELIA MARIA SPANEVELLO1
TAYNA AMARAL VELEDA
THAÍS SCOLARI FRANCESCHI
WILLIAM SANABRIA SIMÕES

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 3.000,00Coordenador

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