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O gênero Pythium compreende mais de 140 espécies de oomicetos termofílicos, ubíquos em ecossistemas lênticos e terrestres de regiões de clima temperado (Kageyama 2014). Enquanto alguns gêneros de oomicetos são sapróbios, outros são patógenos, podendo causar infecções em plantas (Pythium e Phytophthora), insetos (LagenidiumePythium), peixes (Achlya, SaprolegniaePythium) e mamíferos (LagenidiumePythium) (Mendoza; Villela, 2013). A espécie Pythium insidiosum é patógeno de mamíferos, causando a pitiose, uma doença grave, de rápida evolução e difícil tratamento (Gaastra et al., 2010). Embora a pitiose seja descrita em vários países (Mendoza et al., 1996), o maior número de casos é relatado na Tailândia em humanos (Krajaejun et al., 2006, Reanpang et al., 2015) e em equinos no Brasil, sendo que as regiões brasileiras de maior relevância incluem o Pantanal e o Sul do Rio Grande do Sul (RS) que são endêmicas para a infecção, com prevalências estimadas em 12,5% (Santos et al., 2014) e 14,5%, respectivamente (Marcolongo-Pereira et al., 2012; Weiblen et al., 2015).
Pitiose merece destaque pela dificuldade de tratamento e letalidade nas espécies afetadas. Embora, nos últimos anos, os estudos envolvendo protocolos terapêuticos para o tratamento da enfermidade tenham avançado significativamente, a pitiose permanece sendo uma infecção difícil de tratar e muitos indivíduos afetados morrem em decorrência de complicações ligadas à enfermidade ou necessitam de eutanásia. Parte dos insucessos terapêuticos deve-se a deficiente resposta de P. insidiosum às terapias disponíveis, incluindo tratamento com fármacos antifúngicos, cirurgia e imunoterapia (Gaastra et al., 2010).
A cirurgia é o método mais antigo e comumente empregado no tratamento da pitiose em animais e no homem, todavia, taxas de recidiva em torno de 45% são relatadas (Gaastra et al., 2010). Além disso, este procedimento é muitas vezes impedido pelas estruturas anatômicas envolvidas, principalmente os membros na pitiose em equinos (Miller, 1981) e, em muitos casos, requer a amputação e/ou excisão da região afetada na doença em humanos (Krajaejunet al., 2006, Reanpang et al., 2015, Permpalung et al., 2019). A imunoterapia surgiu em 1981 (Miller, 1981) como uma alternativa para o tratamento da pitiose equina e tem sido utilizada até os dias atuais. Embora seja considerada uma prática segura, com índices de cura de aproximadamente 60-70% em equinos e humanos, há muitos casos que não respondem ao imunoterápico (Mendoza; Newton, 2005).
As pesquisas avaliando opções terapêuticas com fármacos antimicrobianos, incluindo prospecção de fármacos empregando compostos antifúngicos, antibacterianos, óleos essenciais de plantas, entre outros, apresentou um incremento considerável nos últimos anos, mostrando resultados animadores in vitro. No entanto, quando aplicados na pitiose clínica ou experimental nem sempre os resultados foram satisfatórios (Pereira et al., 2007; Argenta et al., 2012; Fonseca et al.,2015a; Zanette et al., 2014; Jesus et al., 2016). Recentemente, Ramappaet al. (2017), Ross Castelar (2017) e Bagga et al. (2018) relataram a cura da pitiose ocular em humanos com o uso de azitromicina, minociclina e linezolida. Todavia, em medicina veterinária e, particularmente na pitiose em equinos, o emprego desses fármacos torna-se inviável em função da alta dose a ser empregada o que torna oneroso os custos do tratamento. Desta forma, é imprescindível a continuidade de pesquisas que busquem outras terapias para o tratamento da enfermidade nos animais, principalmente em equinos.
Novas estratégias têm sido pesquisadas e recentemente, nosso grupo de pesquisa comprovou a excelente ação in vitro anti-P. insidiosum de uma nanopartícula biogênica de prata (Valente et al., 2018; Valente et al., 2020). Todavia, estudos avaliando a ação deste composto na pitiose clínica são requeridos para determinar a eficácia desse composto na terapêutica da pitiose.
A ozonioterapia é uma técnica da medicina integrativa que agrega a utilização de 95% de O2 e 5% de O3, podendo ser o gás empregado na forma sistêmica (insuflação retal, auto-hemoterapia maior, auto-hemoterapia menor, auto-hemoterapia intermediária e fluidoterapia ozonizada); local (infusão perilesional, cupping, bagging e água ozonizada) e tópica quando utilizado o óleo ozonizado. O óleo ozonizado tem vantagem sobre a forma gasosa e líquida de ozônio, pois o veículo se mantém em contato com as superfícies, exercendo suas funções por um período superior (López et al., 2003; Bocci, 2005).Além disso, enquanto a meia vida do ozônio sob a forma gasosa é efêmera, sob a forma de óleo pode ser estocado por vários meses, dispensando a necessidade de gerador, o que reduz custos (Bocci, 2005, Jorge et al., 2006).
Relata-se que o ozônio ativa o sistema antioxidante do organismo, aumenta a imunidade e melhora a perfusão sanguínea, o que explica sua ação antimicrobiana, antineoplásica, anti-inflamatória e analgésica (Rodríguez et al., 2018). Estudos sugerem que o ozônio causa lesões na parede celular das bactérias, o que leva a morte desses procariotos (Dähnhardtet al., 2006). Adicionalmente, acredita-se que a sua difusão para o interior das células causa a oxidação de aminoácidos e ácidos nucleicos, impedindo a replicação celular e síntese de aminoácidos, levando à desnaturação e morte dos micro-organismos (Sunnen, 1998; Velano et al., 2001).
Em medicina veterinária, a ozonioterapia tem sido empregada para o tratamento de diversas enfermidades incluindo infecções bacterianas, fúngicas, virais, parasitárias, entre outras (Rodríguez et al., 2018, Quintana et al., 2019). Adicionalmente, Zambrano et al. (2019) evidenciaram a atividade in vitro anti-P. insidiosum do óleo de girassol ozonizado, bem como demonstraram que o crescimento do oomiceto foi inibido após a exposição de kunker com óleo ozonizado.
Acreditamos que a ozonioterapia pode ser empregada na terapia integrativa da pitiose equina, bem como de outras enfermidades causadas por fungos e bactérias, reduzindo o curso clínico da doença. Estudos preliminares desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa têm evidenciado os benefícios da ozonioterapia sistêmica e tópica no tratamento de equinos com pitiose cutânea (dados não publicados). Contudo, o ozônio não deve constar apenas como uma medida paliativa ou inespecífica de tratamento, devendo ser profundamente estudado os seus mecanismos de ação e doses terapêuticas compreendidas cientificamente, para que aliado às terapias convencionais possibilite resultados clínicos expressivos em menor tempo, diminuindo custos e representando uma alternativa terapêutica a ser empregada na prática clínica.

1) Isolados de P. insidiosum (PI): Serão utilizados 45 isolados de P. insidiosum oriundos de animais naturalmente infectados e nove cepas- padrão CBS. Isolados clínicos estão registrados no SISGen (A139392).
2) Obtenção do óleo de girassol: será obtido comercialmente da empresa Ferquima Inc. e Com. Ltda e o óleo de girassol ozonizado (OGO) será adquirido da empresa Ozone&Life.
3) Ensaios de suscetibilidade in vitro: será utilizado o método de microdiluição em caldo, seguindo o documento M38-A2 do CLSI (2008), conforme descrito por Fonseca et al. (2015). A partir da solução-estoque do óleo a ser analisado, serão preparadas dez diluições sucessivas em meio RPMI. Alíquotas de 100µL dessas concentrações serão dispensadas sequencialmente em microplacas, preenchendo os poços pertencentes às colunas numeradas de um a dez. A estas colunas será distribuído um volume de 100µL do inoculo. Para cada teste serão utilizadas colunas controle positivo (inoculo+meio de cultura) e negativo (diluição do óleo+meio de cultura). As placas serão incubadas a 37°C em agitação constante a 75 rpm/48 hs. Todos os testes serão realizados em triplicata e em duas repetições, realizadas em momentos diferentes. A leitura levará em consideração o crescimento ou não de hifas, sendo identificada a concentração inibitória mínima (CIM). As concentrações acima da CIM serão utilizadas para determinação da concentração oomicida mínima (COM). Para isto, 100 μL da diluição serão transferidos para tubos contendo 900 μL de caldo Sabouraud, ficando incubados a 37ºC/ hs. A menor concentração do óleo que não evidenciar crescimento será considerada a COM. Os valores de CIM do óleo de girassol e do OGO serão submetidos a análise estatística utilizando o pacote de software SAS versão 8.2, assumindo uma probabilidade de 5%.
4) Atividade do gás ozônio sobre o micélio de PI: PI (n=20) será cultivado em 50 mL de caldo Sabouraud em estufa de agitação orbital, a 37ºC/72hs. Após crescimento do micélio, gás ozônio será insuflado no interior dos frascos nas concentrações de 50µg/mL, 70µg/mL e 90µg/mL, durante 10 minutos. Os frascos serão incubados em agitação orbital, a 37ºC/24hs. Posteriormente, fragmentos de micélio tratados serão subcultivados em agar levedura 0,1% e incubados a 37ºC/96 hs. O experimento será realizado em triplicata, com duas repetições em momentos diferentes. Como controle positivo será utilizado um frasco de cultivo de PI sem o tratamento com o gás ozônio.
5) Atividade do gás ozônio sobre zoósporos de PI: PI (n=20) será submetido à técnica de zoosporogênese , segundo Pereira et al. (2008). Após a formação de zoósporos, gás ozônio será insuflado no interior dos frascos nas mesmas concentrações e condições conforme descrito acima. Posteriormente, uma alíquota de 100µL do meio de indução será transferida para placas de Petri contendo agar levedura 0,1%, sendo incubada a 37ºC/96 hs. O experimento será realizado em triplicata, com duas repetições em momentos diferentes. Como controle positivo será utilizado um frasco do isolado contendo zoósporos de PI sem o tratamento com o gás ozônio.
6) Microscopia eletrônica para avaliação de danos ocasionados pelos compostos nas células de PI: As análises serão realizadas através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmitância (MET) no Centro de Microscopia Eletrônica do Sul (CEME - SUL) da Universidade Federal de Rio Grande (FURG). Para avaliação dos danos ocasionados pelo óleo de girassol e OGO será utilizada a concentração sub-letal (anterior à CIM) dos compostos avaliados. Para observação dos danos ocasionados pelo gás ozônio sobre o micélio e zoósporos de PI será avaliada a concentração do gás onde não se obteve o crescimento do oomiceto nas subculturas após o tratamento. Controles (sem tratamento) serão submetidos a MEV e MET. Para o preparo das amostras para a MEV será adicionado em um tubo tipo eppendorf 0,3mL da amostra (de cada concentração a ser avaliada e os controles), 1 mL de glutaraldeído 3% em tampão fosfato 0,05 M pH 6,8 e mantidas a 4ºC/48 hs. Após esse período cada tubo será centrifugado durante 5 min/8000 rpm e descartado o sobrenadante. Será adicionado 1 mL de H2O, agitado em vortex por 20 s e centrifugado durante 5 min/ 8000 rpm (repetindo o procedimento 3x). O precipitado será lavado com soluções de etanol (30, 50, 70 e 95%) e cada tubo será agitado em vortex por 20s e centrifugado durante 5 min/8000 rpm, entre cada lavagem sempre descartando o sobrenadante. Após será feita a lavagem do pellet com etanol 95%; etanol puro (100%)/15 min e centrifugada a amostra durante 5 min/8000 rpm. O pellet será colocado em uma placa de Petri deixando secar em estufa a 30°C/3 hs. Após a secagem as amostras serão colocadas em stubs cobertas com ouro-paladio (60 s, 1,8 mM, 2,4 kV), sendo visualizadas a 25 kV de 400 a 5.000 x magnitude. Para a MET as amostras serão centrifugadas a 3500g/10 min.; o sobrenadante desprezado e a amostra lavada com 0.1 mol MgSO4 buffer; sobrenadante desprezado. Posteriormente, será realizada a fixação com glutaraldeído 3% cacodilato buffer (pH 7.2), over night/4°C. Em sequência as amostras serão lavadas 3 vezes consecutivas com cacodilato buffer; lavadas com água destilada (3 lavagens consecutivas) e pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio (OsO4), over night/4ºC. Posteriormente, serão desidratadas em gradiente de etanol (30 a 100%) e acetona e embebidas em resina epoxy.
7) Ensaios de suscetibilidade ex vivo: Os kunkers oriundos de pitiose equina serão cortados em pequenos fragmentos e lavados, durante 10 minutos, em uma solução contendo antimicrobianos (Pentabiótico®). Posteriormente serão lavados com água destilada estéril e seis fragmentos de kunkers serão distribuídos em placas de Petri contendo agar levedura 0,1%, constituindo os seguintes grupos:
- Grupo 1 (controle): placas contendo fragmentos de kunkers sem tratamento; - Grupo 2 (kunkers+óleo de girassol): placas contendo fragmentos de kunkers sobre os quais será dispensado um volume de 50µL do óleo de girassol; - Grupo 3 (kunkers+OGO): placas contendo fragmentos de kunkers sobre os quais será dispensado um volume de 50µL do OGO; - Grupo 4 (kunkers+aplicação de gás ozônio): placas contendo fragmentos de kunkers sobre os quais será insuflado gás ozônio na concentração de 70µg/mL, durante 20 minutos; Grupo 5 (kunkers+gel-pomada de bioAg-NP):As bio-Ag-NP serão gentilmente cedidas pelo Prof. Luciano Panagio da Universidade Estadual de Londrina. A pomada será formulada em uma base gel contendo bioAgNP nas concentrações de 47µg/mL, 235µg/mL e 470µg/mL, baseada em estudos prévios (Valente et al., 2018). Sobre os fragmentos de kunkers será dispensado um volume de 50µL de gel-pomada de bio-AgNP. Para cada placa será avaliada uma concentração diferente de nanopartícula. Cada grupo será avaliado em triplicata. Todas as placas ficarão incubadas em estufa a 37ºC/96 hs, sendo avaliadas diariamente.
8) Avaliação da ozonioterapia em equinos com pitiose clínica: Este estudo será realizado em propriedades rurais do município de Pelotas e região sul do estado do RS. Os equinos com pitiose clínica serão aleatoriamente distribuídos em cinco grupos, com três animais em cada grupo. Os grupos serão divididos conforme a terapia a ser estabelecida. Grupo 1 (Controle): tratados com seis doses de imunoterapia (PitiumVac®) a cada 14 dias, sendo esta a terapia preconizada para o tratamento da pitiose equina;
Grupo 2 (ozonioterapia bagging+OGO tópico): receberá como tratamento a ozonioterapia na forma de bagging (1vez na semana/durante 90 dias) e na forma tópica através do uso do OGO diariamente. O bagging será realizado, nas primeiras três aplicações em concentração de 70µg/mL de ozônio durante 20 minutos. Posteriormente, será utilizada a concentração de 50µg/mL durante 20 minutos. A ozonioterapia será realizada empregando o gerador de ozônio portátil 1.5 (Ozone&Life), registrado na Anvisa sob o número 81509100001.O OGO será aplicado diretamente sobre lesão na forma de bandagem, durante 90 dias; Grupo 3 (ozonioterapia sistêmica+OGO tópico): estes equinos receberão ozonioterapia por insuflação retal, empregando-se gás ozônio na concentração de 17µg/mL, durante 4 minutos, 1 vez na semana. Alternadamente, a ozonioterapia será aplicada pela via de auto hemoterapia menor, empregando-se gás ozônio na concentração 50µg/mL, 1 vez na semana. O OGO será aplicado diariamente, diretamente sobre a lesão na forma de bandagem; Grupo 4 (ozonioterapia bagging e sistêmica+OGO tópico): combinação das terapias descritas para os grupos 2 e 3. O tratamento será realizado nas mesmas condições dos grupos anteriores; Grupo 5: (ozonioterapia bagging+gel-pomada bio-AgNP): esse grupo receberá a combinação de ozonioterapia na forma de bagging (conforme descrito) e na forma tópica através do uso do gel-pomada de bio-AgNP na concentração que apresentar os melhores resultados no experimento ex vivo. O gel-pomada bio-AgNP será aplicado diretamente sobre lesão na forma de bandagem, durante 90 dias. Todos os equinos serão previamente examinados, realizando-se o exame clínico geral, coleta de sangue para realização de hemograma e procedimento cirúrgico para retirada de excesso de tecido de granulação e coleta de kunkers para o isolamento de PI. Durante o tratamento os animais permanecerão em suas propriedades de origem até completa recuperação. As lesões serão avaliadas semanalmente quanto à regressão, regeneração tecidual e cicatrização, sendo estabelecida uma planilha de pontuação. Os dados serão submetidos à análise estatística utilizando o pacote de software SAS versão 8.2, assumindo uma probabilidade de 5%. Este projeto foi submetido e aprovado pelo comitê de ética e experimentação animal da UFPel (CEEA) sob o número 28332-2019

O crescente aumento do número de casos de pitiose em animais e no homem e as dificuldades encontradas para a cura da doença têm impulsionado muitas pesquisas em pitiose; especialmente, direcionadas para o desenvolvimento de novas tecnologias que buscam maior eficácia e ao mesmo tempo sejam economicamente viáveis e ambientalmente comprometidas. Como pesquisadores engajados na área de micologia veterinária, a equipe que propõe o presente estudo, tem como meta corroborar na produção de novos conhecimentos científicos e na busca de tecnologias viáveis que possam ser aplicadas ao tratamento e controle da pitiose em medicina veterinária. As informações originadas neste trabalho poderão ser aplicadas na clínica veterinária como uma terapia combinada e auxiliar à pitiose, proporcionando benefícios ao setor produtivo do País, especialmente à equinocultura. Os resultados gerados ao final deste trabalho servirão de sustentação para o desenvolvimento de outros estudos nesta linha de pesquisa podendo contribuir expressivamente para o desenvolvimento técnico-científico do Brasil.
Com o desenvolvimento do projeto, espera-se dispor de resultados promissores que possam ser aplicados como terapias integrativas e combinadas no tratamento de lesões de pitiose em animais. Adicionalmente, estas terapias poderão ser extensivas ao tratamento da pitiose em humanos. A proposta do emprego de ozonioterapia, bem como de nanotecnologia para o tratamento da pitiose é inovador em pitiose. Adicionalmente, a formulação gel-pomada contendo bio-AgNP gerará um produto com deposição de uma patente. Os dados gerados neste estudo servirão de alavanca para a realização de outras pesquisas, consolidando desta forma, uma linha de pesquisa envolvendo a suscetibilidade de P. insidiosum empregando novas tecnologias. A publicação dos resultados, em periódicos da área e encontros científicos, possibilitará a divulgação dos conhecimentos obtidos com o apoio do órgão de fomento. Adicionalmente, o envolvimento de estudantes de graduação e pós-graduação no projeto resultará na capacitação técnica e na formação de recursos humanos de futuros profissionais, especialmente nas áreas de Medicina Veterinária e Microbiologia/Micologia aplicada.