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A oliveira (Olea europaea L.) é uma cultura com importância considerável no mundo. A espécie está adaptada à Bacia do Mediterrâneo, local geográfico de origem, mas com aumento internacional da demanda, tem ocorrido uma expressiva expansão da cultura para alguns países do Hemisfério Sul (Torres et al., 2017), incluindo Brasil. Entretanto, a produtividade das oliveiras nesses países é consideravelmente menor quando comparado ao local original. De fato, a grande maioria de azeitonas e de azeite consumida no Brasil é importada, o que representa um expressivo impacto na balança comercial. Esse impacto poderia ser minimizado se fosse aumentada a produtividade das oliveiras cultivadas no país, no caso, se os problemas de reprodução fossem resolvidos. Porém, as causas desse problema ainda são especulativas.
Considerando que a maioria dos acessos crescidos nos países do Mediterrâneo e no Brasil são os mesmos, como as cultivares “Arbequina”, “Frantoio”, “Arbosana”, “Koroneiki”, “Picual” e “Manzanilla”, a questão que permanece é quais fatores atrapalham a produtividade das oliveiras cultivadas no Brasil. É claramente conhecido que o ambiente é diferente entre essas regiões, entretanto, seria também uma questão de expressão gênica durante a produção de pólen, sua forma, viabilidade e a própria fecundação, as principais razões por trás dos baixos rendimentos das oliveiras obtidos no Brasil, especialmente no Rio Grande do Sul.
Processos celulares e moleculares complexos ocorrem durante o desenvolvimento da flor e são necessários para a regulação adequada da proliferação e expansão celular, desenvolvimento dos tecidos reprodutivos e a forma final dos órgãos. Algumas cultivares de oliveira são caracterizadas pelo grande número de flores masculinas, devido às altas taxas de aborto dos ovários e dissecação do pistilo. De maneira geral, a ocorrência de danos no pistilo é influenciada por condições nutricionais ou fatores abióticos estressantes, e tem sido proposto que o metabolismo do amido e da sacarose também pode ter um papel importante nesse processo (Alagna et al. 2016).
Mecanismos genéticos também influenciam significativamente o sistema reprodutivo em oliveiras. Por exemplo, a macho-esterilidade, controlada por genes citoplasmáticos, pode ocorrer. No entanto, a autoincompatibilidade e a inter incompatibilidade representam a barreira reprodutiva mais importante nas oliveiras, impedindo a autofecundação e diminuindo as chances de cruzamento e, portanto a a diminuição da produção de azeitonas. O sistema de autoincompatibilidade ainda é desconhecido, mas há evidências de um sistema esporofítico (Alagna et al. 2016).
A sinalização celular adequada e a comunicação célula a célula são cruciais para a aceitação e crescimento do tubo polínico, exigindo uma comunicação intercelular complexa entre flores masculinas e femininas. O crescimento do tubo polínico é influenciado por agentes quimiotróficos, lipídios, íons, proteínas e metabolitos produzidos pelo pistilo. Todas essas rotas são cruciais para a reprodução, pois uma única planta é capaz de produzir 500.000 flores, mas apenas 1 e 2% podem de fato dar frutos. Isso pode ser decorrente de vários fatores, como a síndrome da polinização do vento, defeitos em certos órgãos, barreiras reprodutivas e competição de nutrientes (Alagna et al. 2016). Além disso, outros fatores ambientais podem apresentar um impacto crítico em diferentes etapas do desenvolvimento da flor e a transformação de ovários em azeitonas, principalmente em novas áreas de cultivo, fora da região do Mediterrâneo (Rapoport et al. 2014).
Condições ambientais como temperatura, precipitação e vento, podem afetar fortemente o tempo e a intensidade da floração e a fertilização. Foi bem esclarecido que o ambiente também pode afetar a auto fertilidade em plantas auto incompatíveis. Particularmente, a autoincompatibilidade pode ser superada por altas temperaturas, umidade do ar e tratamentos químicos. Além disso, diferentes ambientes e técnicas de polinização artificial também podem ser favoráveis à auto fertilidade (Alagna et al., 2019). Esses eventos podem ser explicados pelo fato de que a expressão gênica de um determinado organismo pode ser influenciada pelo ambiente externo e interno. Uma das formas de interação entre ambiente e expressão gênica é a regulação epigenética. Epigenética refere-se a alterações hereditárias na arquitetura da cromatina que não envolve alterações nas sequências de DNA, mas modificam a expressão gênica através de modificações no DNA ou histonas (Singroha e Sharma, 2019).
Atualmente, as oliveiras são plantadas nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, no entanto, as condições climáticas dessas regiões diferem das de origem (Martins et al., 2019). Nesse sentido, as principais condições que limitam a olivicultura no país são a ocorrência de eventos extremos associados principalmente à temperatura do ar (Moriondo et al., 2015; Martins et al. 2019), com efeito drástico se ocorrer na floração, polinização e fixação do pólen (Wrege et al., 2015). Além disso, a necessidade térmica é ignorada (Wrege et al., 2015; Martins et al., 2019), sendo mensurada de maneira simples como a soma térmica baseada no acumulo diário em que as plantas se desenvolvem, sendo delimitada por temperaturas mais altas e mais baixas (Freitas et al., 2017).
Outro ponto que deve ser levado em consideração é a forma do pólen. A domesticação da oliveira levou a formação de pólen com aparência selvagem, produzidos por reprodução entre cultivares inicialmente propagadas vegetativamente (Lumaret; Ouazzani 2001; Diez et al., 2015; Unver et al., 2017). De acordo com dados arqueológicos (Besnard et al., 2011; Besnard et al., 2013) e estudos genéticos (Kaniewski et al., 2012), as oliveiras foram domesticadas a partir do ancestral selvagem "oleaster" (O. europaea ssp. europaea var. sylvestris). De maneira geral, oliveiras selvagens (“acebuches”) não podem ser morfologicamente diferenciadas das já domesticadas.
A reconstrução da evolução das oliveiras tem sido difícil de decifrar, pois a cultura é alógama, com uma vida útil longa e fase juvenil prolongada (Miller e Gross, 2011; Unver et al., 2017). Como consequência disso, a reprodução é um processo lento que o homem tem retardado pela propagação vegetativa (Diez et al., 2015), reproduzindo os genótipos selecionados de maneira clonal através de eventos de migração humana (Kaniewski et al., 2012). Isso gerou confusão da identidade taxonômica, uma vez que cada país possui cultivares próprias, e essas geralmente são compartilhadas em áreas de fronteira (Rallo, 2005), o que causou problemas de compatibilidade, pois praticamente todas as árvores são o mesmo genótipo.
Além disso, existe também a hipótese de que os olivais domesticados cruzaram com oleasters (Diez et al., 2015), contribuindo com a diversidade genética para o cultivo, apesar das possíveis barreiras reprodutivas, que são processos críticos para manter a integridade das espécies e geralmente está associado a uma maior divergência genética (De Nettancourt, 2001). Em várias famílias de plantas, há barreiras reprodutivas unidirecional ou também chamado incompatibilidade unilateral, que ocorrem no nível das interações pólen-pistilo (Broz et al., 2017a), sendo frequentemente estudados entre diferentes gêneros ou espécies (De Nettancourt, 2001). No entanto, também há evidências de incompatibilidade unilateral entre populações da mesma espécie (Broz et al., 2017b). A incompatibilidade entre as cultivares de oliveira tem sido ligado ao sistema de acasalamento de plantas, especificamente à autoincompatibilidade (Seifi 2008). Além disso, Broz et al., (2017a) mencionam que, a relação entre autoincompatibilidade e incompatibilidade unidirecional apresentada simultaneamente em algumas famílias de plantas, ocorre devido aos efeitos pleiotrópicos do locus S, uma vez que proteínas S-RNase, proteína HT, S -box Fbox 23 e Cullin1 trabalham nos dois tipos de barreiras reprodutivas, demonstrando sua sobreposição (Broz et al., 2017).
Alguns pesquisadores tem dado ênfase em sistemas especializados de polinização de plantas visitadas por uma variedade de polinizadores (Wozniak; Sicard, 2018), separando-os da polinização por sistemas abióticos (Okubo; Levin, 1989). No entanto, existem plantas que usam o vento e os insetos como serviço de polinização generalista (ambofilia). Filogeneticamente a polinização pelo vento é considerada uma condição derivada de um ancestral polinizado por insetos (Culley et al., 2002). Isso explicaria a morfologia da flor e preferência de transporte pelo vento em oliveira, explicando a reprodução cruzada (Ruiz, 2017). No entanto, Canale e Loni (2010) mencionaram a presença de insetos visitantes dentro dos olivais na Itália, sendo uma alternativa de dispersão de pólen, quando as condições do vento não são favoráveis. Essa entomofilia em potencial é apoiada por estudos morfológicos em grãos de pólen que revelaram características entre as duas preferências de dispersão (Ricciardelli; Intoppa, 2000), deixando perguntas sobre preferências reprodutivas e mecanismos de chegada e recepção ao estabelecer vínculos com estigmas florais.
Considerando o papel do ambiente na expressão de genes relacionados ao processo de desenvolvimento do pólen e fecundação e, por outro lado, a expressão dos genes relacionados à forma do pólen e a importância desses fatores na frutificação e, portanto, no rendimento final, o objetivo deste projeto é elucidar a arquitetura genética por trás da reprodução da oliveira.

Estudo I
O primeiro experimento visa à identificação de genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento e germinação do pólen de um genótipo cultivado no Rio Grande do Sul (oliveiras da empresa Verde Louro) e do mesmo genótipo cultivado em Córdoba (Espanha/Mediterrâneo). Para isso, a cultivar “Picual” será testada como doador de pólen e "Arbequina" como receptor de pólen. O pólen será coletado durante seu desenvolvimento (em “Picual”) e após a polinização (pólen de “Picual” no estigma “Arbequina”).
No caso do pólen após polinização, serão utilizadas árvores da variedade Arbequina, nas quais serão selecionadas inflorescências. Parte das flores de cada inflorescência será utilizada para autopolinização e parte das flores será utilizada em cruzamentos controlados com pólen da outra variedade. Flores selecionadas para polinização cruzada controlada serão emasculadas e protegidas com sacos de papel. Outras flores perfeitas não serão emasculadas e cobertas com saco de papel para impedir a chegada de pólen transportado pelo vento; portanto garantindo que os frutos sejam exclusivos da autopolinização. Após 3 a 5 dias da polinização manual, os tubos polínicos em desenvolvimento serão coletados para análise de expressão gênica. Será feito extração, enriquecimento e sequenciamento do mRNA (RNAseq). Três réplicas biológicas serão coletadas.

Estudo II
O segundo estudo objetiva compreender a evolução da forma do pólen da oliveira (anemofilia e entomofilia). Nesse caso, uma abordagem semelhante será aplicada (RNAseq), no entanto, contrastando uma cultivar elite - "Picual" e um parente selvagem - Olea europaea L. var. sylvestris, sendo ambos cultivados em Córdoba, Espanha. Três réplicas biológicas serão coletadas.

RNASeq
As amostras coletadas (pólen) serão fixadas em N2 líquido e posteriormente armazenadas a -80ºC até extração de RNA. O RNA será extraídusando o PureLinkTM Plant RNA Reagent® (Invitrogen). O RNA será tratado com DNase I (InvitrogenTM). Para ambos os estudos, as amostras serão enviadas ao Centro de Genômica Funcional, na Universidade de São Paulo (http://www.esalq.usp.br/genomicafuncional/), para executar o sequenciamento de RNA (RNAseq).
As amostras de RNA (RNAbulk) serão submetidas à análise em Bioanalyzer, para verificar integridade do RNA e se é apropriado para sequenciamento. As bibliotecas de sequenciamento serão preparadas com o kit TruSeq RNA Sample Preparation ® V 2 (Illumina ™). Finalmente, o sequenciamento será realizado no equipamento Illumina HiSeq2500 V4 2x100 (Maia et al., 2016).
Após obtenção das leituras, a montagem e a análise serão realizadas usando os genomas de referência disponíveis, tanto das espécies cultivadas (Cruz et al. 2016) quanto das selvagens (Unver et al. 2017). Isso permitirá a representação de genes diferencialmente expressos sob as condições testadas.
Para a análise e visualização da qualidade das leituras, o software FastQC será utilizado. A seguir, o software Trimmomatic Ver. 0,32 será usado para remover sequências com baixa qualidade e dos adaptadores. Na primeira fase, o software TopHat Ver. 2.0.11 e Bowtie Ver. 0.12.7 será utilizado para mapear as leituras nos genomas modelo. Na segunda fase, as leituras serão contadas e a expressão diferencial de cada loco por meio do software Cufflinks (Trapnell et al., 2010).
Os “Fragmentos por Kilobase de exon por milhão de fragmentos mapeados (FPKM)” serão usados para calcular a abundância da expressão gênica e para a análise final dos dados usando o pacote DESeq (Geng et al., 2018). Por fim, o pacote cummRbund (Trapnell et al. 2010), selecionando apenas transcrições com FPKM com Log2FC ≤ –1 ou ≥ +1 e Pvalue ≤ 0,05 (Maia et al., 2016).
As transcrições obtidas serão anotadas usando “Cluster of Orthologous Groups of protein (COG)”, atribuindo funções às sequências. A análise de anotação dos transcritos para identificar as rotas metabólicas serão realizadas usando Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Finalmente, a análise mais detalhada será realizada através de um alinhamento dos transcritos nas bases de dados: GO, COG, KEGG, Swiss-Prot e NCBI usando o software BLAST (Lipman, 1990). Os resultados desta etapa também serão usados no software BLAST2GO, buscando ontologias gênicas (Conesa et al., 2005; Geng et al., 2018; Maia et al., 2016).

Estudo III - Caracterização do pólen
Será feita a caracterização do pólen das cultivares “Arbequina”, “Frantoio”, “Arbosana”, “Koroneiki”, “Picual” e “Manzanilla”. O tamanho dos grãos de pólen, área, diâmetro longitudinal e diâmetro equatorial serão avaliados em microscópio óptico de 100X.
As análises das características ultraestruturais da parede de grãos (intina, endexina, estrato basal, ectexina, colunas e distâncias entre colunas), serão realizadas com um microscópio de transmissão eletrônica. As amostras serão previamente fixadas com glutaraldeído 2% e paraformaldeído 4% em tampão cacodilato de sódio 0,05M (pH 7,2), por 12 horas a 4°C, sendo submetido a pós-fixação com tetróxido de ósmio 1% em tampão 0,05M de cacodilato de sódio (pH 7,2) por 3 horas em temperatura ambiente com agitação. Mais três lavagens serão realizadas com tampão cacodilato de sódio 0,05M (pH 7,2). Posteriormente, será realizada a desidratação em soluções ascendentes de etanol de 30 a 100%. As incubações serão realizadas em soluções de óxido de propileno e EPON até a amostra ser incluída na resina. Os cortes serão feitos com ultramicrótomo para obtenção de cortes de 90 nm de espessura.
Os caracteres exina, altura e largura da parede, área do lúmen e distância entre elementos estruturais serão avaliados com um microscópio eletrônico de varredura. As amostras serão preparadas fixando-as com glutaraldeído a 3% em tampão fosfato sódio 0,025M (pH 6,8) e preservado em uma solução de formaldeído a 1% e álcool a 30%. Então as amostras serão desidratadas com etanol de 30 a 100%. Para observação sob microscópio, as amostras serão fixadas com polímeros e banhadas em ouro vaporizado, fazendo as observações de 4000X a 25000X.
A análise de fluorescência de pólen será realizada em microscópio confocal de varredura à laser, capturando a autofluorescência de forma independente a 590-650 nm e 650LP nm, gerando várias sessões ópticas projetadas no mesmo plano, capturando e quantificando em unidades de intensidade por unidade de área (UA / µm2).

Estudo IV - Teste de viabilidade do pólen
Para determinar a viabilidade dos grãos de pólen, será utilizado o método de germinação in vitro através de meio de cultura específico para germinação de grãos de pólen de oliveira. O meio de cultura será composto de 4 g L-1 de ágar, 90 g L-1 de sacarose, 400 mg L-1 de ácido bórico e pH ajustado para 5,79, mantido por 60 horas a 28°C (Silva et al., 2016).
A receptividade do estigma será testada usando o método de peróxido de hidrogênio a 3% (H2O2). Este método consiste na deposição de peróxido de hidrogênio a 3% no estigma das flores, no qual os estigmas que mostrarem formação de bolhas serão considerados receptivos (Ruiz et al., 2018).

Espera-se com essa proposta trazer novos conhecimentos para elucidar a arquitetura genética que governa a processo de reprodução em oliveiras, de modo a contribuir com estratégias que visem o aumento da produtividade das oliveiras no Rio Grande do Sul.
Além disso, este projeto permitirá o desenvolvimento de conhecimentos importantes sobre biologia de plantas da reprodução. Finalmente, é preciso enfatizar que este projeto contribuirá com a formação e treinamento de um número importante de estudantes, de graduação a pós-doutorado, e gerar trabalhos científicos de alto impacto, que serão os veículos para a difusão do conhecimento.