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A resistência aos antibióticos é um sério problema de saúde pública, devido ao uso indiscriminado de antibióticos em humanos e animais a sua utilização, como também através do uso de produtos e derivados de animais tratados com antibióticos. A origem da resistência pode ser genética ou não. Em 2018, a Organização Mundial da Saúde) divulgou dados de vigilância sobre resistência aos antibióticos e revelou altos níveis de resistência a uma série de infecções bacterianas graves em países de alta e baixa. Dentre as bactérias com capacidade de resistência a diversas classes de antimicrobianos podemos destacar a Acinetobacter baumannii, uma bactéria Gram-negativa aeróbica, catalase-positiva, não móvel e não fermentadora, com morfologia típica de cocobacilos Esta bactéria é encontrada no trato gastrointestinal humano e pode ser considerado um patógeno oportunista associado com a ocorrência de surtos de infecções hospitalares (LI et al., 2016). Dentre as complicações geradas pela infecção por esse microrganismo, estão: bacteremia, septicemia, meningites, infecções do trato respiratório e urinário e infecções em feridas e tecidos moles. Os estudos de pangenoma fornecem maneiras de identificar elementos funcionais discriminatórios que podem explicar diferenças fenotípicas entre bactérias patogênicas, além de possibilitar a identificação de proteínas comuns a estes organismos, que podem ser alvos para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas
Para isso, estudo de genomas de bactérias locais usando ferramentas de bioinformática podem facilitar a compreensão de características genômicas que estejam associadas ao processo de patogênese desta bactéria. Estas abordagens permitem o processamento destas informações e o cruzamento de dados de diferentes fontes de modo a facilitar a mineração de informações relevantes e identificação de novos insights referentes ao entendimento do patógeno prever epítopos antigênicos promíssores. Além disso, a análise dos genomas deste organismo também pode auxiliar na identificação de genes com potencial aplicação no desenvolvimento de vacinas eficazes, na produção de anticorpos e utilização no desenvolvimento de soroterapias

3.1 Cepas (isolados), cultivo e extração de DNA

Dez isolados clínicos de A. baumannii obtidos de paciente internados em hospital da cidade de Pelotas, RS, Brasil, serão utilizados nos experimentos, os isolados serão doados pelo Hospital Escola (HE) da Universidade Federal de Pelotas previamente identificado pelo sistema automatizado VITEK 2® GN (bioMérieux, France). Os isolados de A. baumannii serão plaqueados em caldo BHI (Brian Heart Infusion - Infusão de Cérebro e Coração) e Ágar Bacteriológico a 1,5% para crescimento a 37°C por 18 horas. As colônias isoladas seram repicadas e crescidas em BHI por 18 horas a 37°C para a extração do DNA total. Utilizando o Kit Wizard Genomic DNA purification (Promega), segundo instruções do fabricante DNA e armazenamento a - 20°C. O DNA obtido será quantificado e analisado quanto ao grau de pureza utilizando NanoDrop 2000 (NPT 3 – Núcleo de Plataforma Tecnológicas/CPqAM).
3.2 Analise de Bioinformática que será realizada no projeto
A metodologia que será utilizada para analisar os genomas completos de A. baumannii, fazendo uso de ferramentas de bioinformática será realizado com a colaboração do laboratório de Bioinformática e Proteomica- BioProLab, PPG Biotecnologia UFPEL, coordenado pelo Prof. Dr.Luciano da Silva Pinto.


3.2.3 Mapeamento de epítopos das proteínas alvo
O conceito de vacinas peptídicas baseia-se na identificação e síntese de epítopos de células B e T que são imuno-dominantes e podem gerar respostas imunes específicas significativas. A imuno-informática envolve várias abordagens computacionais combinatórias para prever epítopos de células B e T. As proteínas priorizadas obtidas seguindo a estratégia acima mencionada seram submetidas a etapas de mapeamento de epítopos seqüenciais. A virulência dos epítopos candidatos será estimada usando Virulent Pred.

3.2.4 Análise de conservação de epítopos e modelagem comparativa de estrutura protéica
Uma análise de conservação é realizada para estimar o nível de conservação de sequência nas regiões dos epitópos através das cepas incluídas de A. baumannii (proteínas priorizadas). O grau de similaridade ou variabilidade de uma proteína específica ou região do epitopo pode fornecer informações significativas sobre correlatos estruturais, funcionais, evolutivos e imunológicos. respectivamente. A exposição da superfície de epítopos candidatos às proteínas facilita a geração de forte resposta imunogênica. O peptídeo será empregado para revelar a topologia dos epítopos dentro das estruturas das proteínas. É essencial garantir o arranjo dos epítopos para que a parte imunogênica não seja dobrada dentro da proteína globular.

3.2.5 Anotação funcional das proteínas previstas e análise de interação proteína-proteína (PPI)
A análise funcional auxilia no estudo do comportamento biológico, molecular e bioquímico das proteínas. Aqui o Blast2GO (RRID: SCR_005828) será empregado para anotação funcional das proteínas priorizadas. Cluster de grupos ortólogos (COG) e vias biológicas / molecular. As interações entre as proteínas constituem a espinha dorsal da função celular e o estudo de tais interações ajuda a entender o mecanismo molecular e os processos biológicos, elucidar as bases moleculares das doenças e identificar possíveis alvos terapêuticos.

3.3 Construção de vetores de expressão com genes sintéticos otimizados para E.coli.
As sequências de aminoácidos das proteínas serão obtidas através do banco de dados NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e analisadas através do software Vector NTI para o desenho dos primers. Sequências correspondentes ao peptídeo sinal serão identificadas através do software online Signa lP-5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) e removidas.. Sequências nucleotídicas correspondentes aos sítios de restrição de enzimas (BamHI, PstI e EcoRI) serão adicionadas às extremidades dos primers para posterior clonagem em vetor plasmidial pAE.
Os genes serão amplificados através da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando DNA genômico de Acinetobacter baumannii ATCC 19606 e os primers correspondentes. Os genes serão clonados em vetor pAE através da digestão com enzimas de restrição (BamHI, PstI e EcoRI) e ligação com DNA ligase T4. Os plasmídeos pAE contendo os genes codificantes serão utilizados para transformar uma cepa E. coli BL21 Star (DE3) por eletroporação. O cultivo transformado será plaqueado em meio ágar Luria Bertani (LB) contendo 100 µg/mL de ampicilina para triagem dos clones recombinantes. As proteínas serão purificadas através de cromatografia de afinidade utilizando colunas HisTrap carregadas com níquel e a quantificação das proteínas será feita através de kit BCA Protein Assay (Pierce, USA). A detecção das proteínas recombinantes será avaliada através das técnicas de Western blotting e ELISA a partir da utilização de anticorpos anti-6Xhistidine conjugados a peroxidase.

3.4 Detecções das proteínas por soro de humanos naturalmente infectados por A. baumannii
Soros humanos provenientes de pacientes com infecção causada por A. baumannii, serão coletados e doados pelo Hospital Escola (HE) da Universidade Federal de Pelotas para a realização destes experimentos. Ensaios do tipo ELISA (Enzyme-Linked Immuno sorbent Assay) e WB (Western Blotting) serão utilizados para avaliar a reação dos soros com as proteínas recombinantes.

3.5 Produção, titulação e isotipagem de anticorpos policlonais
A produção de anticorpos policlonais (pAbs) em camundongos será realizada conforme descrito por Mc Connell et al. (2006), com adaptações. Os antígenos recombinantes terão suas concentrações ajustadas a 0,4 mg/mL através de diluição em solução estéril de PBS 1X. As administrações nos animais serão realizadas pela via subcutânea nos dias 0, 14 e 21 e os antígenos serão administrados separadamente, sendo os animais divididos em grupos de dois animais cada: grupo. A primeira dose (dia 0) será composta de 100 µL do antígeno acrescido do Adjuvante Completo de Freund, na proporção de 1:1 (20 µg de antígeno por aplicação). As doses subseqüentes (dias 14 e 21) serão compostas de Adjuvante Incompleto de Freund, nas mesmas diluições e metodologias de imunização. O sangue dos animais será coletado nos dias 7, 18 e 25 para separação do soro. O soro será obtido através da incubação do sangue a 37 °C por 30 min, seguido de centrifugação (5000 x g 7 min) e coleta do sobrenadante. Os títulos de anticorpos serão obtidos através de ensaio de ELISA, como descrito anteriormente. A titulação dos soros será através da metodologia de diluição seriada de base dois. Os isotipos IgM e IgG e suas subclasses serão avaliados através da aplicação do ensaio de ELISA indireto.

3.6 Ensaios de fagocitose dependente de anticorpo (opsonização)
O ensaio de fagocitose será conduzido como descrito por (Luo et al., 2012), com algumas modificações. Isolados A. baumannii serão cultivados em caldo BHI overnight a 37°C, lavados, quantificados e adicionados em placas de 96 cavidades. Soros imunes e não imunes serão adicionados em diferentes concentrações (10, 20, 30, 40 e 50%) e mantidos por 1 h. Macrófagos murinos RAW 264.7 (American Type Culture Collection) serão previamente cultivados (37°C, 5% CO2) em meio RPMI 1640 acrescido de 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina, estreptomicina e glutamina e 50µM de β-mercaptoetanol. As células serão ativadas através da exposição à 100nM de PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) durante um período de três dias. Macrófagos ativados serão adicionados as cavidades em proporções de 1:5, 1:10 e 1:20 (bactérias por macrófagos). Após 1 h de incubação com leve agitação, os conteúdos das cavidades serão removidos e plaqueados em meio ágar BHI para contagem de UFC (Unidades Formadoras de Colônias). Os resultados serão expressos conforme a porcentagem de células bacterianas viáveis em comparação com a média do grupo controle (soro não-imune).

3.7 Modelo animal
Serão utilizados seis camundongos fêmeas de BALB/C com 6 - 8 semanas de idade neste estudo. Os animais serão mantidos em caixas de polipropileno próprias no Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), sendo alocados dois animais por caixa e os mesmos alimentados com ração e água ad libitum. Todos os experimentos serão conduzidos conforme as regulamentações, princípios e políticas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas.

Metas
• Sequenciar, montar e anotar nos dois primeiros meses de execução do projeto, pelo menos um isolado local de A. baumannii;
• Identificar no mínimo três proteínas imunogênicas para a construção de vetores de expressão nos primeiros 8 meses;
• Expressar em bactérias e purificar as proteínas resultantes até os primeiros 12 meses;
• Produzir os anticorpos policlonais nos primeiros 6 meses do segundo ano de atividades;
• Avaliar o potencial destes anticorpos in vitro até o 9º mês do segundo ano do projeto;
• Fechamento das análises, redação dos resultados em forma de patente, artigos científicos e relatório até o último mês de execução desta proposta.

Resultados e impactos esperados

A descoberta de novos agentes antibacterianos, bem como, o desenvolvimento de novas estratégias que controlem infecções causadas por patógenos como A. baumannii, tem estimulado diversos estudos nos últimos anos. Isto se deve, principalmente, ao crescente número de isolados caracterizados como altamente resistentes às mais diversas classes de antimicrobianos disponíveis e com isso, a falta de estratégias terapêuticas eficientes. O presente estudo visa colaborar nestas linhas de pesquisa, buscando pelo desenvolvimento de um produto biotecnológico eficaz no tratamento dessas infecções. Utilizando ferramentas de bioinformáticas para análise seqüenciais e identificação de proteínas que estão na superfície celular ou secretadas e, ao mesmo tempo, essenciais, homólogos virulentos e não hospedeiros. As proteínas priorizadas após a passagem por esses critérios são consideradas candidatas adequadas e serão mais exploradas por seus epítopos, interações proteína-proteína, topologia de superfície, modelagem comparativa de homologia e análise funcional abrangente. A exploração aprimorada recente de pan-genômica, fatores de virulência, ilhas resistentes a antibióticos, ilhas de patogenicidade de A. baumannii provavelmente agilizarão a identificação e desenvolvimento de candidatos eficazes contra o referido patógeno. Estudos de larga escala como o nosso, abrangendo pan-genômica, genômica comparativa, vacinologia reversa e imunoproteômica, contribuiriam para o planejamento racional contra A. baumannii.
Sendo assim, acredita-se ser possível uma terapia a base de anticorpos específicos contra algumas proteínas extracelulares de A. baumannii. Sendo que a escolha destes alvos baseia-se na localização dos epítopos, uma vez que são proteínas presentes em um anexo bacteriano altamente relacionado com a adesão do patógeno aos tecidos do hospedeiro, processo este que desencadeia a colonização bacteriana e desenvolvimento do processo infeccioso, dificultando a ação de fármacos e a eliminação desses patógenos.
A estratégia deste trabalho baseia-se na obtenção desses antígenos de forma recombinante em sistema procarioto E. coli, uma vez que esta metodologia já é muito bem estabelecida. Acredita-se que esses antígenos recombinantes sejam capazes de induzir uma resposta imune significativa, de forma a ser possível a obtenção de soro contendo anticorpos policlonais em títulos elevados. Além disso, estima-se que esses antígenos recombinantes se apresentem com estrutura e propriedade antigênica semelhante ao que ocorre in vivo. A hipótese do estudo, baseado na abordagem combinatória de pan-genômica, genômica central, proteômica e vacinologia reversa, nos levará a descobrir possíveis candidatos a imunização contra A. baumannii, podendo este projeto resultar também na identificação de alvos potenciais ao desenvolvimento de uma vacina. A integração de estratégias de vacinologia e soroterapia computacional poderão facilitar o combate à rápida disseminação de A. baumannii resistente, demonstrar a importância dessas proteínas no processo de colonização bacteriana, bem como, a funcionalidade do produto para fins terapêuticos e sua aplicação em diversos segmentos hospitalares.