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A agricultura tem enfrentado diversos fatores que afetam a produtividade de plantas cultivadas, dentre eles, os mais importantes danos são causados por insetos, doenças e competição com plantas daninhas (Cagliari et al., 2019). Plantas daninhas compreendem o maior fator biótico que limita a produtividade de espécies cultivadas bem como a segurança alimentar. Algumas plantas daninhas são consideradas mais problemáticas e nocivas devido a sua ocorrência generalizada, a grande interferência na produtividade e o difícil manejo (Bajwa et al., 2016).
Nesse sentido, a resistência aos herbicidas em plantas daninhas é um dos principais problemas enfrentados pelo setor agrícola. Desde a introdução do glifosato como um herbicida comercial em 1974, mais de 45 espécies de plantas daninhas já desenvolveram mecanismos de resistência a este agente (revisado por Duke, 2019). A introdução da soja transgênica resistente ao glifosato promoveu um aumentado significativo no uso deste herbicida, o que pode atuar na seleção de espécies resistentes ao herbicida (Pittelkow et al., 2009).
Levando em consideração estes importantes fatores que afetam a produção vegetal, os progressos significativos nas técnicas genética reversa tem contribuído com a agricultura moderna nos últimos anos. A elucidação do mecanismo de silenciamento gênico em organismos eucariontes, chamado de RNA de interferência (RNAi), realizada por Fire e colaboradores em 1998, é considerado um dos maiores progressos. O RNAi é um sistema de silenciamento gênico pós-transcricional é e um mecanismo natural da regulação da expressão gênica e do sistema de defesa contra vírus em células eucarióticas (Fire et al., 1998). Através deste sistema, ocorre a degradação do RNA mensageiro (mRNA) e redução ou eliminação completa da expressão do gene alvo.
O silenciamento gênico pode ser desencadeado no organismo alvo pelo suprimento de RNAs em duas formas, a entrega de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) ou entrega direta de pequenos RNAs (sRNAs) (Cagliari et al., 2019). Em plantas, o mecanismo de RNAi é desencadeado por um RNA fita dupla (dsRNA – double stranded RNA) (Dalakouras et al., 2019). Uma vez na célula vegetal, os dsRNAs são processados por uma endonuclease, DICER-LIKE (DCL) em pequenos fragmentos de 21-24 nucleotídeos (nt), chamados de pequeno RNA de interferência (siRNA – short interfering RNAs). Os siRNAs vegetais possuem 2 nt coesivos na região 3’, o que os mantém estabilizados através da metilação pela proteína HUE ENANCER1 (HEN1). Após esta modificação e dependendo do nucleotídeo na região 5’ terminal, uma das fitas do RNA (sRNA) é alocada na proteína ARGONAUTA (AGO) (revisado por Dalakouras et al., 2019). A proteína AGO mais o sRNA compõem o Complexo de Silenciamento Induzido por RNA (RISC - RNA-induced silencing complex). O sRNA funciona como um guia para direcionar o RISC para o RNA alvo através do pareamento complementar de bases (revisado por Fang e Qi, 2016). A função da AGO é de clivagem endonucleolítica de seu alvo de RNA em uma única ligação fosfodiéster. A estrutura da AGO garante que a clivagem esteja sempre entre os nt alvo emparelhados com o décimo e décimo primeiro nt do RNA guia (Cenik e Zmore, 2011). De forma interessante, a natureza do mecanismo de RNAi é conservado entre os eucariotos (Lindbo, 2012), podendo assim ser aplicado em uma ampla gama de espécies vegetais.
Levando em consideração o potencial do mecanismo de RNAi no silenciamento gênico em plantas, a utilização de RNAi combinada com as técnicas de engenharia genética tem sido utilizada desde o final da década de 80. Os primeiros ensaios com plantas transgênicas as quais foi inserido RNAi exibiram supressão e silenciamento gênico (Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990) demonstrando o potencial dessa ferramenta na biotecnologia vegetal. A indução do mecanismo RNAi ocorre pela inserção de um dsRNA via transformação genética utilizando o sistema viral VIGS (virus-induced gene silencing) e o sistema bacteriano plasmidial com inserção via Agrobacterium tumefaciens (Dalakouras et al., 2019). Pesquisadores tem utilizado o RNAi para estudos da função gênica, para a indução de resistência a vírus, insetos e nematoides bem como na engenharia de metabolitos (Lindbo, 2012). Um dos mais importantes marcos na agricultura foi a utilização do mecanismo RNAi no desenvolvimento do tomate transgênico FLAVR SAVRTM, desenvolvido pela Monsanto em 1994. O FLAVR SAVRTM possui um dsRNA guia para o gene codificante para a poligalacturonase, levando o silenciamento do gene e promovendo atraso no amolecimento da poupa (ISAAA, 2020). Apesar da sua potencialidade como ferramenta para melhorar características de interesse agronômico, a utilização de RNAi via transgenia tem enfrentado críticas severas que afetam a sua aprovação (Dalakouras et al., 2019). Além disso, é estimado um custo de 140 milhões de dólares para comercializar uma planta transgênica (Rosa et al., 2018).
Nesse sentido, tem surgido nos últimos anos, estratégias de indução do mecanismo RNAi envolvendo aplicação exógena de moléculas de RNA (GMO-free). O primeiro registro da aplicação exógena de RNA desencadeando o mecanismo RNAi em plantas, foi descrito em 2011, através da patente da Monsanto envolvendo a aplicação de dsRNA através de aspersão em Nicotiana benthamiana, produzindo um sRNA dirigido para a o gene codificante para fitoeno desnaturase (Sammons et al., 2011, patente nº: US20110296556A1). Além de aspersão, outros métodos de entrega de RNA foram testados, como infiltração foliar (Numata et al., 2014) e através de irrigação, após a observação de que as raízes podem absorver RNA (Jiang et al., 2014; Li et al., 2015). No entanto, a estrutura das células vegetais, que apresentam parede celular compostas majoritariamente de celulose e que podem variar em espessura, compreendem uma barreira física na entrega do RNA. Para facilitar a entrega do RNA dentro das células vegetais, as moléculas de RNA são usualmente conjugadas com compostos carreadores (Jiang et al., 2014; Numata et al., 2014). Dentre os compostos já descritos, estão o peptídeo transportador carregado positivamente, nanopartícula fluorescente catiônica e nanoestruturas de DNA (Jiang et al., 2014; Numata et al., 2014, Li et al., 2015, Zhang et al., 2019). Controversamente, apesar de os conjugantes facilitarem a entrega do RNA, existe um custo elevado para sua produção e dificuldades para sintetizá-los (Dalakouras et al., 2019). Frente a isso, pesquisadores tem desenvolvido estratégias de baixo custo e alta eficiência para a entrega do RNA, como aspersão em alta pressão e aplicação através de escovação da superfície foliar (Dalakouras et al., 2016; Dubrovina et al., 2019). A Startup NanoSur, dos Estados Unidos da América (EUA), desenvolveu um método de modificação química pós-transcricional do RNA, dsRNA modificado (MdsRNA - modified double strand RNA), o qual está protegido sob patente nos EUA (Patente nº 10,131,911 - https://patents.justia.com/patent/10131911). Em geral, a modificação química compreende uma modificação na região 2’OH da ribose. A modificação química pós-transcricional melhora a estabilidade do dsRNA no ambiente e durante a ingestão por organismos hospedeiros, no entanto são suscetíveis a degradação eventual no ambiente, reduzindo o impacto ambiental. Além disso, o MdsRNA pode ser produzido em larga escala. O MdsRNA pode ser utilizado para silenciar a expressão de genes que causam a morte, inibição do crescimento ou redução da reprodução em animais, fungos ou plantas daninhas.
A utilização de RNAi em sistemas não transformáveis tem sido utilizado para a proteção de espécies cultivadas contra insetos, nematoides e patógenos (revisado por Zhang et al., 2013; Kim et al., 2015; Lombardo et al., 2016; McLoughlin et al., 2018; Zotti et al., 2018; Liu et al., 2019; Werner et al., 2019). Apesar da eficiência comprovada da utilização de RNAi no controle de pragas e doenças, não há registros na literatura do uso de RNAi em sistemas não transformáveis para o controle de plantas daninhas. Dessa forma, este projeto tem como objetivo o estudo da utilização desse sistema no controle de crescimento de plantas daninhas, utilizando o arroz como planta modelo para os testes iniciais de tamanho do dsRNA, eficiência de entrega e eficiência de entrega do MdsRNA e do dsRNA encapsulado em nanopartícula. Através deste projeto é esperado o desenvolvimento de um método de entrega de dsRNA para desencadeamento do mecanismo RNAi em plantas daninhas, utilizando um MdsRNA.

Atividade 1 – Desenvolvimento de dsRNAs para o controle de plantas daninhas
Os genes alvo para o sistema RNAi serão escolhidos por pertencerem ao metabolismo basal sendo dessa forma, de fácil identificação fenotípica e de importante efeito no caso de sileciamento gênico. Os genes HPPD (4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase) para PDS (Phytoene desaturase) do arroz (Oryza sativa L.) serão obtidos no banco do genoma do arroz The Rice Annotation Project (RAP) database (https://rapdb.dna.affrc.go.jp/).
Para o desenvolvimento de moléculas de dsRNA que sejam capazes de ativar o sistema de RNAi, serão utilizados fragmentos de 200, 400, 600 e 800pb. Os fragmentos serão obtidos utilizando dois conjuntos de oligonucleotideos: o primeiro flanqueia a região específica em relação ao tamanho do amplicon desejado na CDS (região codificante do gene) enquanto o segundo conjunto servirá para inserir a mínima sequência requerida do promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') ao fragmento amplificado com o primeiro conjunto de oligonucleotídeos.
Para o desenvolvimento das moléculas de dsRNA, os fragmentos referentes aos targets serão obtidas a partir de uma biblioteca de cDNA, para evitar a presença de introns, utilizando os oligonucleotídeos específicos. Com a biblioteca de cDNA, serão realizadas as reações de amplificação dos fragmentos correspondente aos targets.
A síntese das moléculas de dsRNA será realizada utilizando os fragmentos específicos já com a região T7 obtidos nas reações de amplificação. Os fragmentos serão convertidos em dsRNAs utilizando o kit MEGAscript® RNAi (Ambion). Após os dsRNAs serão verificados quanto a presença e integridade em eletroforese em gel de agarose.
A eficiência de entrega do dsRNA será acessada através de diferentes formas de introdução das moléculas de dsRNA. Os testes serão realizados em ambiente controlado expondo a raiz de plântulas de arroz (estadio V3) a solução contendo o dsRNA, através da injeção das moléculas em folhas das plântulas e através de injuria foliar induzida com material perfuro cortante. A eficiência de ativação será verificada a partir da análise fenotípica da planta, acessando o fenótipo esperado e através de qRT-PCR. Os fragmentos que forem capazes de ativar o sistema RNAi e silenciar com eficiência e especificidade os genes alvo, serão selecionados para a síntese de MdsRNA. A síntese das moléculas será realizada pela Startup NanoSur (http://www.nanosur.com/) em Miami nos EUA. As moléculas de MdsRNA serão testadas conforme descrito para os testes das moléculas de dsRNA sintetizadas in house.

Atividade 2 – Desenvolvimento de dsRNAs para o controle de insetos
Serão selecionados genes-alvo candidatos que, ao serem silenciados, resultem na morte, reversão de resistência a inseticidas sintéticos ou modificação morfológica que impeçam ou reduzam o dano do inseto-praga na cultura. Estes genes-alvo serão buscados em bancos de dados de RNA-seq. O dsRNA será obtido a aprtir da amplificação de uma bibilioteca de cDNAs utilinzando oligonucleotideos especificos para os genes alvo.
Os insetos serão injetados com dsRNA, seguindo uma metodologia adaptada de Prentice et al. (2017). Os insetos microinjetados serão utilizados para montagem de ensaio de letalidade e para quantificação da expressão gênica em qRT-PCR. Os genes-alvo candidatos mais responsivos ao silenciamento gênico nos ensaios de microinjeção serão avaliados novamente, por via oral. Será realizada a quantificação da expressão gênica, como descrito anteriormente.
Silenciamento gênico induzido por vírus será realizado a partir das leituras brutas de RNAseq. Os domínios funcionais das espécies de vírus identificadas serão anotados usando o software Interproscan (JONES et al., 2014). As espécies de vírus predominantes serão selecionadas para as próximas etapas do projeto. Será realizado o isolamento das partículas virais dos vírus selecionados a partir da homogeneização de insetos infectados em tampão adequado e ultracentrifugação. Uma alíquota do isolado será utilizada para extração de RNA, síntese de cDNA e PCR com primers desenhados para a confirmação da presença dos vírus selecionados nos isolados. Com uma alíquota do isolado, serão realizados ensaios de infectividade in vitro e in vivo. Os ensaios in vitro serão realizados em placas de seis poços, através da adição do isolado viral nos poços contendo meio de cultura e células das linhagens S2 (Drosophila melanogaster) e Sf9 (Spodoptera frugiperda). A viabilidade celular será realizada através da contagem de células antes e durante o ensaio. A carga viral será aferida através da extração de RNA celular, síntese de cDNA e quantificação por PCR em tempo real (qPCR) utilizando primers específicos para cada espécie de vírus selecionadas. Para realização dos ensaios in vivo, será fornecida dieta artificial misturada com uma alíquota do isolado viral para insetos imaturos. Serão aferidas a mortalidade e a carga viral diariamente. As amostras de cDNA sintetizadas na seção anterior serão utilizadas para amplificação do genoma viral completo, usando um par de primers desenhados com sítios de restrição específicos não encontrados no genoma do vírus ou no plasmídeo ao qual ele será ligado. A ligação do genoma viral será realizada em um plasmídeo vetor de expressão, contendo sequência promotora T7 em posição upstream da região de múltipla clonagem (MCS). O plasmídeo com o genoma do vírus será modificado, com a inserção de uma sequência completa da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) e de sequencias de ribozimas auto cliváveis nas extremidades do genoma. Os plasmídeos modificados serão utilizados para transcrição in vitro com enzima T7 RNA polimerase, seguindo as instruções do fabricante. Os transcritos serão preparados com reagente específico para formação de lipossomos e transfecção em linhagem celular adequada ou em insetos inteiros.
O clone infeccioso obtido na etapa anterior será modificado, com a inserção de uma região MCS contendo sítios de restrição. Essa região será utilizada para introdução das sequencias dos genes-alvo específicos para silenciamento no inseto-alvo. Sequencias de 200-300 nucleotídeos pertencentes aos genes-alvo serão amplificados, com primers contendo sítios de restrição diferentes em ambas as terminações. Os sítios de restrição inseridos serão os mesmos presentes na região MCS inserida no clone infeccioso, permitindo a ligação das sequencias do gene-alvo. Após realização de transformação, clonagem e purificação dos vetores virais contendo os genes alvo, estes serão utilizados para produção de partículas virais em linhagem celular adequada ou em insetos vivos, via transfecção. As partículas virais produzidas serão purificadas por centrifugação e utilizadas para avaliar a eficiência do silenciamento no inseto-alvo, em decorrência da infecção e replicação do vírus modificado. As partículas virais recombinantes serão fornecidas por alimentação para insetos imaturos. Um tratamento de controle será estabelecido com o fornecimento de dieta com partículas virais não modificadas, e um segundo controle com insetos imaturos em dieta artificial sem vírus. Os insetos serão mantidos por 10 dias nas respectivas dietas. A mortalidade será avaliada diariamente e 8 insetos serão coletados por dia para extração de RNA, sínese de cDNA e reação de qPCR para quantificar a expressão dos genes-alvo nos insetos tratados.

Atividade 3 – Formulação de conjugantes
O nanoencapsulamento de agentes bioativos como o RNA interferente (RNAi) poderá ser feito utilizando, por exemplo, vesículas poliméricas, nas quais o agente bioativo aloja-se no seu interior da mesma. Ainda, poderão ser utilizadas nanopartículas poliméricas sólidas, as quais atuam como reservatório do material encapsulado controlando assim a sua liberação.
Para formulação desses sistemas de nanoencapsulamento serão utilizados polímeros de origem natural ou sintética. Dentre esses, o polietilenoglicol, a poli-ε-caprolactona, a quitosana, a celulose e o alginato serão testados como materiais de partida. A modificação da estrutura desses polímeros também ampliará o escopo de trabalho uma vez que novas propriedades e novos materiais poderão ser preparados.
Com relação à formação dos sistemas nanoparticulados, esses serão produzidos por diferentes técnicas dentre as quais podemos mencionar processos de auto-montagem ou sistemas de emulsão. Esses métodos são amplamente descritos na literatura como sendo maneiras eficientes para obtenção de materiais em escala nanométrica. Vale ressaltar que a escolha do método levará em consideração fatores como tipo de polímero, tipo de aplicação e característica do agente ativo que será encapsulado. Sendo assim, um planejamento cuidadoso será realizado junto com toda a equipe técnica a fim de que o processo de nanoencapsulamento do RNAi seja eficiente.

METAS
Meta M1: Identificação de genes alvo
• M1.1: Busca dos genes alvo, até o terceiro mês;
• M1.2: Desenho dos oligonucleotídeos para amplificação da sequência alvo, até o quarto mês;
• M1.3: Síntese dos dsRNAs in vitro, até o nono mês;
• M1.4: Testes de funcionalidade, até o nono mês.
Meta M2: Teste de eficiência e funcionalidade
• M2.1: Teste em casa de vegetação, até o décimo oitavo mês;
• M2.2: Processamento dos dados e publicação, até o vigésimo quarto mês.