Nome do Projeto
Investigação dos processos fisiopatológicos e das comorbidades envolvidas em um modelo de fibromialgia em camundongos machos e fêmeas.
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/05/2020 - 01/05/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A fibromialgia, uma síndrome de dor crônica generalizada prevalente em mulheres, é predominantemente caracterizada pela sensibilidade e pela fadiga na musculatura esquelética associada à distúrbios psicológicos que, em conjunto, prejudicam negativamente a qualidade de vida destes pacientes. Dentro desse contexto, está bem estabelecido que a exposição ao estresse induz não somente transtornos de humor e de ansiedade, mas também mantém e amplifica a severidade da dor. Apesar da etiologia e da patogênese da fibromialgia ser considerada ainda desconhecida, diversos estudos demonstraram o envolvimento do estresse oxidativo, da disfunção mitocondrial e da via apoptótica na fisiopatologia da dor crônica em modelos animais. Além disso, estas adaptações celulares e moleculares parecem contribuir para o desenvolvimento da sensibilização central, presente em diversas etiologias de dor crônica, incluindo da fibromialgia. Portanto, o objetivo do presente projeto consiste em investigar os processos fisiopatológicos envolvidos, assim como as comorbidades associadas em um modelo de fibromialgia induzido pelo estresse frio intermitente (EFI) em camundongos machos e fêmeas. Serão utilizados camundongos machos e fêmeas da raça Swiss. Os animais serão remanejados para um ambiente à temperatura controlada de 4 ± 2°C a partir das 16:30 até as 10:00h do próximo dia. Na manhã seguinte, os animais serão expostos a diferentes temperaturas ambientais, alternando entre 4 e 22 ± 2°C a cada 30 min, até às 16:30h, quando serão realocados no ambiente à 4 ± 2°C durante a noite. Este mesmo procedimento será repetido no dia seguinte, sendo que a partir das 10:00h do quarto dia do protocolo experimental, os camundongos serão adaptados a uma temperatura de 22 ± 2°C por 1h, no mínimo, antes da realização dos testes comportamentais. Enquanto isso, os camundongos pertencentes ao grupo controle serão mantidos a uma temperatura constante de 22 ± 2°C durante o protocolo experimental. Transcorrido o período de adaptação, os animais serão submetidos aos testes comportamentais para avaliar o desenvolvimento da alodinia mecânica, da miastenia e da hiperalgesia térmica, característicos da fibromialgia. Em um primeiro momento, estes testes serão realizados a cada três dias para determinar a curva tempo-resposta dos efeitos nociceptivos induzidos pelo EFI nos camundongos. Em um segundo momento, para investigar o envolvimento da sensibilização central na patogênese da fibromialgia, serão administrados antagonistas e/ou precursores dos sistemas glutamatérgico, serotoninérgico e nitrérgico em um outro grupo de animais expostos ao EFI. Logo após, serão realizados os mesmos testes comportamentais descritos acima. Com o intuito de investigar os mecanismos fisiopatológicos e o desenvolvimento de comorbidades associadas à fibromialgia, um outro grupo de camundongos será exposto ao EFI. Após o período de adaptação, além dos testes comportamentais relacionados à nocicepção, serão realizados os testes do campo aberto e do labirinto em cruz elevada para avaliar a atividade locomotora e exploratória, assim como o desenvolvimento do fenótipo ansiogênico nos animais expostos ao EFI. No dia seguinte, os camundongos serão eutanasiados através de sobredosagem de anestésico e as amostras de sangue, assim como os tecidos do córtex cerebral, do hipocampo e da medula espinhal serão coletadas para posterior realização das análises bioquímicas e moleculares.

Objetivo Geral

Investigar os processos fisiopatológicos envolvidos, assim como as comorbidades
associadas em um modelo de fibromialgia em camundongos machos e fêmeas.

Justificativa

A fibromialgia, doença reumática mais comum, é caracterizada como um tipo de dor crônica generalizada em todo o corpo, especialmente no que se refere aos músculos esqueléticos (LAWSON, 2016). Estima-se que a fibromialgia atinge cerca de 1% da população mundial dentre a faixa etária de 50 a 70 anos, sendo que as mulheres são mais susceptíveis a desenvolverem esta síndrome (OEZEL et al., 2016).
Modernamente, a fibromialgia tem sido definida pelos cientistas e pela junta médica como uma “dor disfuncional” uma vez que a dor crônica generalizada característica da fibromialgia, frequentemente desencadeia uma ampla gama de distúrbios clínicos, tais como a síndrome do intestino irritável, a doença da articulação temporomandibular, o déficit de memória e os distúrbios de sono e de humor (CLAUW, 2014; SHMYGALEV et al., 2014). Nesse contexto, a fibromialgia tem sido considerada um encargo significativo para a saúde púbica visto que afeta negativamente a qualidade de vida da população e consequentemente, pode ser atribuída a incapacidade dentro de um contexto social e econômico (JAHAN et al., 2012; MONTSERRAT-DE LA PAZ et al., 2013).
Enquanto a maioria das síndromes dolorosas são diagnosticadas através dos processos etiológicos envolvidos nas mesmas, o da fibromialgia é realizado através da descrição dos sintomas pelo paciente. Apesar da complexidade e das limitadas informações sobre a etiologia desta síndrome, diversos fatores parecem estar envolvidos no desenvolvimento dos sintomas característicos da fibromialgia, incluindo a susceptibilidade genética, os estímulos nocivos e não nocivos, os traumas físicos, a idade, a especificidade de gênero e o sofrimento psicológico (STAUD e RODRIGUEZ, 2006; McBETH e MULVEY; 2012). Ainda, há substanciais evidências que relacionam o estresse e as alterações no processamento da dor à nível central com a cronicidade e a intensificação da dor em pacientes com fibromialgia (SLUKA e CLAUW, 2016).
Diante disso, sugere-se que esta síndrome seja de origem neurogênica uma vez que a fibromialgia promove a amplificação na percepção da dor (SLUKA et al., 2001). O desenvolvimento deste fenômeno denominado sensibilização central ocorre através de um desequilíbrio neuroquímico no sistema nervoso central (SNC). Nessas circunstâncias, o aumento na liberação de glutamato e a consequente ativação dos receptores do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) intensificam a sensibilização das fibras A, δ e C dos neurônios aferentes primários e assim, produz nocicepção (HAUSER et al., 2015; ONG et al., 2019). Além disso, a alodinia e a hiperalgesia característica da fibromialgia pode estar associado a alterações na atividade dos sistemas serotoninérgico, noradrenérgico e opioidérgico, os quais representam a via descendente inibitória da dor (DADABHOY et al., 2008).
Por outro lado, outros estudos também sugerem o envolvimento do óxido nítrico (ON) na sensibilização central (LITTLE et al., 2012). O aumento no influxo de cálcio (Ca+2), através da ativação dos receptores NMDA, desencadeia a ativação da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), seguido do aumento da produção de ON (OESS et al., 2006). O ON, por sua vez, ativa cascatas intracelulares relacionadas ao desenvolvimento da hiperalgesia secundária e à inibição da via descendente da dor (MICLESCU e GORDH, 2009). Além do ON, o aumento no influxo de Ca+2 favorece a geração exacerbada das espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs), a qual inicia e propaga uma série de eventos tóxicos dentro das células, incluindo a disfunção mitocondrial e a liberação de proteínas apoptóticas (SALVEMINI et al., 2011; ARETI et al., 2014; CARVAJAL et al., 2016).
Nesse âmbito, a disfunção de múltiplos sistemas orgânicos desencadeada pela fibromialgia dificulta o desenvolvimento de um modelo pré-clínico semelhante a esta síndrome. Os modelos animais de uma determinada doença devem mimetizar tanto a sintomatologia, como a etiologia e principalmente, serem preditivos de tratamentos eficazes. Ademais, eles são considerados ferramentas válidas para o desenvolvimento de novos tratamentos e para a melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes à doença (SLUKA, 2009). Portanto, um modelo animal ideal para a fibromialgia deveria incluir não só a dor generalizada, mas também as demais comorbidades associadas.
Apesar das dificuldades, alguns modelos pré-clínicos para a fibromialgia foram propostos e validados, os quais baseiam-se em insultos múltiplos de baixa intensidade, na depleção de aminas biogênicas no SNC e no estresse inevitável (DESANTANA et al., 2013). Particularmente, o modelo do estresse frio intermitente (EFI) mimetiza muitas das características clínicas apresentadas por pacientes com fibromialgia, tais como a dor crônica generalizada predominante em roedores fêmeas (NISHIYORI e UEDA, 2008). Ainda, em conformidade com as terapias clínicas disponíveis para pacientes com fibromialgia, os camundongos expostos ao EFI não foram responsivos ao tratamento com a morfina, enquanto que os fármacos antidepressivos, particularmente os inibidores da recaptação de monoaminas, foram efetivos em reverter a hiperalgesia térmica e mecânica nestes animais uma vez que eles reestabeleceram a ativação da via inibitória da dor serotoninérgica descendente (NISHIYORI et al., 2010; NISHIYORI et al., 2011).
Tendo em vista que a fibromialgia envolve diversos processos fisiopatológicos pouco elucidados, os quais podem estar associados com a heterogeneidade dos sintomas apresentados por pacientes diagnosticados com esta síndrome, torna-se relevante a validação e a otimização de modelos animais já propostos para a fibromialgia. Nesse contexto, o protocolo do EFI tem sido explorado como um promissor modelo animal para fibromialgia, entretanto mais estudos são necessários tanto para investigar as comorbidades associadas a esse modelo, como para a melhor compreensão dos processos fisiopatológicos envolvidos, incluindo o estresse oxidativo, o dano mitocondrial e a via apoptótica.

Metodologia

Para a realização deste protocolo, serão utilizados camundongos machos e fêmeas da raça Swiss. Os animais serão remanejados para um ambiente à temperatura controlada de 4 ± 2°C a partir das 16:30 até as 10:00h do próximo dia. Na manhã seguinte, os animais serão expostos a diferentes temperaturas ambientais, alternando entre 4 e 22 ± 2°C a cada 30 min, até às 16:30h, quando serão realocados no ambiente à 4 ± 2°C durante a noite. Este mesmo procedimento será repetido no dia seguinte, sendo que a partir das 10:00h do quarto dia do protocolo experimental, os camundongos serão adaptados a uma temperatura de 22 ± 2°C por 1h, no mínimo, antes da realização dos testes comportamentais. Enquanto isso, os camundongos pertencentes ao grupo controle serão mantidos a uma temperatura constante de 22 ± 2°C durante o protocolo experimental. Transcorrido o período de adaptação, os animais serão submetidos aos testes comportamentais para avaliar o desenvolvimento da alodinia mecânica, da miastenia e da hiperalgesia térmica, característicos da fibromialgia. Em um primeiro momento, estes testes serão realizados a cada três dias para determinar a curva tempo-resposta dos efeitos nociceptivos induzidos pelo EFI nos camundongos. Em um segundo momento, para investigar o envolvimento da sensibilização central na patogênese da fibromialgia, serão administrados antagonistas e/ou precursores dos sistemas glutamatérgico, serotoninérgico e nitrérgico em um outro grupo de animais expostos ao EFI. Logo após, serão realizados os mesmos testes comportamentais descritos acima. Por fim, com o intuito de investigar os mecanismos fisiopatológicos e o desenvolvimento de comorbidades associadas à fibromialgia, um outro grupo de camundongos será exposto ao EFI. Após o período de adaptação, além dos testes comportamentais relacionados à nocicepção, serão realizados os testes do campo aberto e do labirinto em cruz elevada para avaliar a atividade locomotora e exploratória, assim como o desenvolvimento do fenótipo ansiogênico nos animais expostos ao EFI. No dia seguinte, os camundongos serão eutanasiados através de sobredosagem de anestésico e as amostras de sangue, assim como os tecidos do córtex cerebral, do hipocampo e da medula espinhal serão coletadas para posterior realização das análises bioquímicas e moleculares. Em relação as dosagens bioquímicas, serão determinados os níveis das espécies reativas de oxigênio (ERO), das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e de tióis não-proteicos (NPSH), assim como a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT) e sódio/potássio-ATPase (Na+, K+-ATPase). Quanto aos ensaios moleculares, serão analisados os genes do citocromo c (Cit c) e das caspases 3, 8 e 9 através da técnica da reação da cadeia polimerase em tempo real (qRT-PCR).

Indicadores, Metas e Resultados

Através do desenvolvimento deste projeto espera-se elucidar as comorbidades associadas à fibromialgia e obter uma melhor compreensão dos processos fisiopatológicos envolvidos, incluindo o estresse oxidativo, o dano mitocondrial e a via apoptótica. Após a compreensão destes parâmetros, novas estratégias terapêuticas poderão ser propostas.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANGÉLICA SCHIAVOM DOS REIS
CAROLINA CRISTOVÃO MARTINS
CRISTIANE LUCHESE1
EDUARDA BRAGA FERNANDES
ETHEL ANTUNES WILHELM1
VANESSA MACEDO ESTEVES DA ROCHA

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