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Obtenção de população base para possibilitar o sucesso da implementação de um programa de melhoramento

EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO E CHECAGEM
O DNA genômico total será extraído usando separação orgânica pelo protocolo de Cloreto de Sódio (BARRERO et al.,2008). Para checagem da integridade do DNA obtido, as amostras serão submetidas a eletroforese horizontal com gel de agarose 1% e tampão SB 1X durante 30 minutos a 120 volts. Para tal, será usada uma alíquota de 7 μL de DNA sendo o mesmo corado com 1.1 μL de GelRed (Biotium, Inc.) e 3 μL de Gene Ruler 100pb (Thermo Fisher Scientific) e posteriormente visualizados em transiluminador L-PIX (Loccus Biotecnologia).
DESENHO DE PRIMERS E VALIDAÇÃO
Serão utilizadas as sequências do genoma de Oreochromis sp. contidas no banco de dados GenBank, sendo o mesmo pertencente ao National Center for Biotechnology Information – NCBI. Para triagem e posterior desenho de primers serão estabelecidos os seguintes parâmetros utilizando o software Primer3: temperatura de melting (Tm) entre o primer forward e reverse inferior a 5°C, conteúdo GC inferior a 55%, tamanho do primer preferencialmente entre 18 a 22 bases, repetição da sequência motif de 8 a 12 vezes, eleição de loci microssatélites unicamente tetranucletídeo e amplicon com tamanho inferior a 500 pb . Ainda, para viabilidade do multiplex (análise simultânea de vários amplicons), serão preconizados loci que apresentem tamanhos moleculares distintos. Após varredura do genoma, dentre os loci potencialmente amplificáveis sugeridos pelo software, serão eleitos 10 marcadores microssatélites que melhor se adequarão aos critérios pré-estabelecidos. Para otimização da amplificação e validação dos primers, a eficiência do mesmo será testada utilizando-se diferentes concentrações na reação, bem como uma PCR gradiente, na qual várias temperaturas de anelamento serão testadas de forma concomitante..
AMPLIFICAÇÃO DAS REGIÕES MICROSSATÉLITES E GENOTIPAGEM
Após validação, os marcadores microssatélites serão amplificados através da técnica de reação de PCR cujo o volume final será 25μL, contendo 1μL de DNA genômico, 1μL de cada primer (Forward e Reverse -10pmol), 2,5μL de 10X PCR buffer (10mM Tris HCl pH 8.3 ; 500 Mm KCl, 15 mM MgCl2 ) 0,5μL de dNTP (Thermo Fisher Scientific -100 mM), 1μL de JumpStartTM REDTaq Polymerase® (Sigma-Aldrich) e 18μL de água livre de nuclease. O controle negativo (reação sem a presença de DNA) será utilizado em cada amplificação para confirmar a ausência de contaminação.
A posterior checagem da amplificação do produto de PCR será realizada por meio de eletroforese em gel de agarose a 1%, utilizando uma alíquota de 4 µL de produto de PCR onde os mesmos serão analisados em transiluminador sob luz UV e registrados digitalmente. Após amplificação serão realizadas a purificação do DNA utilizando o Kit Gen Elute Gel Extraction Kit (Sigma- Aldrich) segundo as instruções do fabricante para posterior sequenciamento das regiões microssatélites (Macrogen – Coréia). A genotipagem será conduzida por meio de eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 10%, utilizando uma alíquota de 3 µL de produto de PCR, 1.1 µL de GelRed , bem como Gene Ruler 100 pb (Fermentas Life Science) e Low Ladder 20 pb (Sigma-Aldrich) como referência para estimação do tamanho dos fragmentos amplificados.
ANÁLISE DE DADOS
Para análise, os alelos dos loci serão discriminados através de observação direta no gel, baseando-se na presença ou ausência de bandas de tamanhos moleculares idênticos (mesmo locus). Com base nas informações obtidas, serão avaliadas a diversidade genética do plantel, sendo a mesma caracterizada pelas frequências alélicas, heterozigosidade observada, diversidade gênica esperada segundo o equilíbrio de Hardy-Weinberg, número de alelos por locus, porcentagem de loci polimórficos, índice de fixação de Wright e distância genética, bem como coeficiente endogâmico e de parentesco dos indivíduos analisados, sendo estas estimativas obtidas pelo uso dos softwares Arlequin e Genepop 4.0.

São esperados como resultados o conhecimento da variabilidade genética do material estudado