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A ecotoxicologia é uma importante ferramenta na avaliação de risco ambiental (NIVA; BROWN, 2019). Minhocas são utilizadas em testes ecotoxicológicos devido à sua exposição constante aos contaminantes através da pele e trato gastrointestinal (NUSAIR; ZAROUR, 2016). Quando expostos à contaminantes, estes organismos podem apresentar efeitos agudos, ocasionados a curto espaço de tempo e/ou crônicos, expostos por períodos mais prolongados. Este último avalia principalmente efeitos subletais, como reprodução, alterações morfológicas e crescimento. Um dos parâmetros é a morfologia dos tecidos do trato gastrointestinal, pois estão envolvidos diretamente no processamento dos contaminantes. Esses tecidos são o epitelial de revestimento, responsável pela digestão e absorção das substâncias e o tecido cloragógeno. Este consiste em células peritoneais achatadas que são responsáveis por manter a homeostase de substâncias no sangue e no líquido celomático, removendo excretas, transportando nutrientes entre os tecidos e mantendo o pH do corpo. Semelhante às funções do fígado (EDWARDS; BOHLEN 1996). Sendo assim, alterações nos tecidos de absorção e no cloragógeno poderia alterar a saúde do organismo e consequentemente seu papel ecológico no ambiente.

O estudo será realizado em laboratório, na Embrapa Clima Temperado- Estação Experimental Cascata (EEC) e no Departamento de Morfologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
Baseando-se e adaptando-se às recomendações dos protocolos OECD (1984; 2004); ISO (1993; 1998); CETESB (1990); ABNT (2007; 2014), minhocas da espécie E. andrei serão obtidas do minhocário da EEC. Estas serão mantidas em laboratório, acomodadas em caixa de plástico resistente, com substrato de pó de fibra de coco e esterco bovino (50:50 v/v), com pH neutro e mantidas a 20 ± 2º C. O esterco, obtido de uma propriedade de produção de base ecológica, será seco em estufa a 60ºC, processado em um triturador de resíduos e peneirado em peneiras de 2mm para obtenção de partículas menores.

Teste Ecotoxicológico

A ecotoxicologia pode ser definida como a ciência que estuda os efeitos adversos de substâncias naturais ou sintéticas sobre os organismos vivos, populações ou comunidades (animais ou vegetais) nos ambientes terrestres e aquáticos (BIANCHINNI; MARTINS, JORGE, 2009).
Os ensaios são realizados expondo-se os organismos-teste a um solo contaminado, objetivando-se avaliar o efeito da contaminação na sobrevivência, crescimento, reprodução, mudanças comportamentais, dentre outros fatores (NIVA; BROWN, 2019)

O solo utilizado para os testes ecotoxicológicos será formulado, de acordo com as recomendações ISO/OECD. Este consiste em uma mistura de 70% de areia industrial fina, 20% de caulim P.A e 10% de matéria orgânica (pó de fibra de coco) (GARCIA, 2004). 400g deste solo serão inseridos nos recipientes testes, os quais consistem em caixas organizadoras de plástico transparente, retangulares, obtendo capacidade de volume total de 1,02L com tampa perfurada para permitir as trocas gasosas e evitar a fuga de indivíduos. Em seguida os solos receberão o tratamento como produto comercial Roundup Transbord R (480 g/L eq.ac) em 6 concentrações incluindo o controle, conforme Tabela.1.
A umidade será verificada em torno de 60%, e o pH medido conforme indicação das normas já citadas.

Tabela 1 – Tratamentos e concentrações de Glifosato utilizadas no experimento
Tratamentos mg eq. ac/ kg-1
1 0
2 0,96
3 3,84
4 15,36
5 61,44
6 245,76


Doze indivíduos serão lavados, pesados e inseridos em cada unidade experimental, alimentados semanalmente com esterco bovino seco e triturado. Para cada concentração serão realizadas 4 repetições, totalizando 24 unidades experimentais.
Os recipientes e os organismos serão pesados semanalmente.
O ensaio terá duração total de 56 dias, sendo que na metade deste tempo (28 dias) os indivíduos adultos serão retirados, mantendo-se nas unidades experimentais somente casulos e juvenis, os quais serão contabilizados ao final do experimento.
Para avaliar o tempo de exposição sobre os tecidos será retirado um indivíduo por unidade experimental semanalmente para a realização das análises histológicas.

Análises histotológicas

Os indivíduos selecionados para avaliação histológica serão identificados e deixados por 2h em papel filtro umedecido para que seja efetuada a limpeza do conteúdo intestinal. Após este período, estes serão fixados em formol 10% por um período de 24h. Logo após, o material será cortado transversalmente aproximadamente no 35° segmento e a peça será colocada em frasco contendo álcool 70%, 80% e 90% respectivamente, por 40 minutos. A seguir, as peças levarão três banhos de 40min de álcool absoluto e três banhos de xilol. Adiante, serão colocadas em cassetes histológicos de plástico e banhadas em parafina, mantidas em estufa para o processo de inclusão em parafina. Depois de parafinado o material será cortado em micrótomo a 0,7mm, colocado em lâminas e levado à estufa. Em seguida será feito o processo de coloração com Hematoxilina e Eosina e a montagem da lâmina.
Para a análise histológica, serão visualizadas e fotografadas três lâminas por indivíduo e cada lâmina contendo 4 cortes seriados. Serão medidos os comprimentos dos tecidos cloragógeno e epitelial através do software Image Pro-Plus®, sendo feitas três medidas por fotografia, além de observadas e fotografadas possíveis alterações nos demais tecidos.

INDICADORES

- Alteração morfológica dos tecidos
- Perda de peso
- Número de juvenis aos 56 dias de experimento


METAS

- Utilizar a histologia como indicador de poluição do solo;
- Identificar o nível de uso seguro de glifosato, a partir do qual o impacto sobre o bioindicador não é significativo estatisticamente;


RESULTADOS ESPERADOS

Informações sobre o impacto do glifosato na espécie Eisenia andrei, relacionados as modificações em tecidos epitelial de revestimento do intestino e o cloragógeno.