O estudo será realizado em laboratório, na Embrapa Clima Temperado- Estação Experimental Cascata (EEC) e no Departamento de Morfologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
Baseando-se e adaptando-se às recomendações dos protocolos OECD (1984; 2004); ISO (1993; 1998); CETESB (1990); ABNT (2007; 2014), minhocas da espécie E. andrei serão obtidas do minhocário da EEC. Estas serão mantidas em laboratório, acomodadas em caixa de plástico resistente, com substrato de pó de fibra de coco e esterco bovino (50:50 v/v), com pH neutro e mantidas a 20 ± 2º C. O esterco, obtido de uma propriedade de produção de base ecológica, será seco em estufa a 60ºC, processado em um triturador de resíduos e peneirado em peneiras de 2mm para obtenção de partículas menores.
Teste Ecotoxicológico
A ecotoxicologia pode ser definida como a ciência que estuda os efeitos adversos de substâncias naturais ou sintéticas sobre os organismos vivos, populações ou comunidades (animais ou vegetais) nos ambientes terrestres e aquáticos (BIANCHINNI; MARTINS, JORGE, 2009).
Os ensaios são realizados expondo-se os organismos-teste a um solo contaminado, objetivando-se avaliar o efeito da contaminação na sobrevivência, crescimento, reprodução, mudanças comportamentais, dentre outros fatores (NIVA; BROWN, 2019)
O solo utilizado para os testes ecotoxicológicos será formulado, de acordo com as recomendações ISO/OECD. Este consiste em uma mistura de 70% de areia industrial fina, 20% de caulim P.A e 10% de matéria orgânica (pó de fibra de coco) (GARCIA, 2004). 400g deste solo serão inseridos nos recipientes testes, os quais consistem em caixas organizadoras de plástico transparente, retangulares, obtendo capacidade de volume total de 1,02L com tampa perfurada para permitir as trocas gasosas e evitar a fuga de indivíduos. Em seguida os solos receberão o tratamento como produto comercial Roundup Transbord R (480 g/L eq.ac) em 6 concentrações incluindo o controle, conforme Tabela.1.
A umidade será verificada em torno de 60%, e o pH medido conforme indicação das normas já citadas.
Tabela 1 – Tratamentos e concentrações de Glifosato utilizadas no experimento
Tratamentos mg eq. ac/ kg-1
1 0
2 0,96
3 3,84
4 15,36
5 61,44
6 245,76
Doze indivíduos serão lavados, pesados e inseridos em cada unidade experimental, alimentados semanalmente com esterco bovino seco e triturado. Para cada concentração serão realizadas 4 repetições, totalizando 24 unidades experimentais.
Os recipientes e os organismos serão pesados semanalmente.
O ensaio terá duração total de 56 dias, sendo que na metade deste tempo (28 dias) os indivíduos adultos serão retirados, mantendo-se nas unidades experimentais somente casulos e juvenis, os quais serão contabilizados ao final do experimento.
Para avaliar o tempo de exposição sobre os tecidos será retirado um indivíduo por unidade experimental semanalmente para a realização das análises histológicas.
Análises histotológicas
Os indivíduos selecionados para avaliação histológica serão identificados e deixados por 2h em papel filtro umedecido para que seja efetuada a limpeza do conteúdo intestinal. Após este período, estes serão fixados em formol 10% por um período de 24h. Logo após, o material será cortado transversalmente aproximadamente no 35° segmento e a peça será colocada em frasco contendo álcool 70%, 80% e 90% respectivamente, por 40 minutos. A seguir, as peças levarão três banhos de 40min de álcool absoluto e três banhos de xilol. Adiante, serão colocadas em cassetes histológicos de plástico e banhadas em parafina, mantidas em estufa para o processo de inclusão em parafina. Depois de parafinado o material será cortado em micrótomo a 0,7mm, colocado em lâminas e levado à estufa. Em seguida será feito o processo de coloração com Hematoxilina e Eosina e a montagem da lâmina.
Para a análise histológica, serão visualizadas e fotografadas três lâminas por indivíduo e cada lâmina contendo 4 cortes seriados. Serão medidos os comprimentos dos tecidos cloragógeno e epitelial através do software Image Pro-Plus®, sendo feitas três medidas por fotografia, além de observadas e fotografadas possíveis alterações nos demais tecidos.