Portal InstitucionalUFPEL

Acinetobacter baumannii é uma bactéria com formato de cocobacilo, gram-negativo, não fermentador, encapsulado, estritamente aeróbico, sem motilidade, oxidase negativa e catalase positiva. É considerada a espécie mais importante do gênero, e emergiu como um patógeno oportunista, que afeta principalmente pacientes imunocomprometidos, internados em unidades de terapia intensiva (UTIs), e associados a equipamentos invasivos (ventilação mecânica e cateteres) (NEETHU et al.,2018; PAGANO, et al., 2016; SINGH, et al., 2013). Além disso, é uma espécie não fastidiosa, capaz de se desenvolver e sobreviver em condições adversas, contribuindo para a transmissão, e aumentando os casos de infecções transmitidas no ambiente hospitalar, tais como: pneumonias, meningites, septicemias, e infecções do trato urinário (NEETHU, et al., 2018).
Surtos de infecções nosocomiais graves, causadas por esse agente, têm sido relatados nos hospitais em todo o mundo, resultando em alta taxa de mortalidade e gerando um problema de saúde pública, uma vez que A. baumannii apresenta resistência a vários antimicrobianos, e em razão disso, tem aumentado o número de cepas multirresistentes (MDR) nos últimos anos (ASPAS, et al., 2018; CORREA, et al., 2017; JASPER, et al., 2016; LOB, et al., 2016; NI, et al., 2015; SU, et al., 2014).
Essa resistência aos antimicrobianos pode estar relacionada a diferentes mecanismos, como: enzimas inativadoras de antibióticos, canais de porina, mecanismos de efluxo, alteração das funções alvo ou celular devido a mutações, além do comportamento não estático em condições adversas, e o uso indiscriminado e não controlado de antimicrobianos (FALAGAS, et al., 2010; HUWAITAT, et AL., 2016; NEETHU, et al., 2018; SINGH, et al., 2013).
Na década de 70, A. baumannii era suscetível aos betalactâmicos de amplo espectro, cefalosporinas e tetraciclinas. Atualmente os carbapenêmicos são os antibióticos de escolha para o tratamento de infecções causadas por este patógeno. Entretanto, a disseminação de cepas de A. baumanni resistentes a esta classe de antibióticos, devido a produção de enzimas carbapenemases, fez com eles perdessem sua efetividade ao longo dos anos, deixando poucas opções terapêuticas disponíveis. Com o aumento da multiresistência e o baixo número de novos antimicrobianos no mercado, o retorno de drogas usadas anteriormente foi incentivado, assim tem ocorrido com as polimixinas (grupo de antibiótico polipeptídico) (MENEGUCCI, et al., 2016; NI, et al., 2015; RODRÍGUES, et al., 2018; SADEGHI, et al., 2016).
As polimixinas foram descobertas no final dos anos 40, e utilizadas amplamente até meados da década de 80, quando foram abandonadas devido a efeitos adversos (nefrotoxicidade), e mantidas apenas para o tratamento de infecções pulmonares em pacientes com fibrose cística, e em soluções tópicas com outros antimicrobianos. Recentemente, foi reintroduzida no arsenal terapêutico como droga de último recurso, para o tratamento de infecções causadas por bactérias gram-negativas multirresistentes, como A. baumannii (FALAGAS, et al., 2010; FALAGAS, RAFAILIDIS, MATTHAIOU, 2010; KASSAMALI, et al., 2015).
As polimixinas geralmente apresentam potente atividade in vitro contra A. baumannii, entretanto, apesar de sua reintegração relativamente recente na prática clínica, a resistência já constitui uma questão importante, devido principalmente à modificação pós-translacional do lipopolissacarídeo (molécula que formam a camada externa da membrana externa), ao estreito espectro terapêutico e aos efeitos colaterais graves, além da heterorresistência (JEANNOT, et al., 2017; KASSAMALI, et al., 2015).
A heterorresistência em A. baumannii é particularmente preocupante para população de pacientes neutropênicos (nível muito baixo de neutrófilos), sem um sistema imune intacto para prevenir o crescimento bacteriano após a exposição à polimixinas, esses pacientes podem estar em maior risco de desenvolver e abrigar isolados resistentes. Estratégias clínicas, incluindo novos regimes de dosagem, e combinação de antibioticoterapia, estão sendo propostos como solução para prevenir a resistência emergente em pacientes com infecções por A. baumannii tratados com polimixinas (KASSAMALI, et al., 2015; NI, et al., 2015).
Neste contexto, o desenvolvimento de um novo agente terapêutico capaz de demonstrar eficácia e segurança em infecções graves se justifica diante da crescente resistência global. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 700 mil pessoas morrem todos os anos por causa de bactérias resistentes. Estima-se que no ano de 2050, 10 milhões de pessoas poderão vir a óbito (BRASIL, 2017).
Assim, novos produtos, podem ter um importante papel no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes. A nanotecnologia surge como alternativa no desenvolvimento de novos antibióticos ou de novas estratégias de tratamento. As nanopartículas de prata (AgNPs) surgem como promissoras, em razão da sua significativa e comprovada propriedade antimicrobiana. Essas partículas, são capazes de penetrar na membrana celular, ou anexar-se a superfície bacteriana, com base no seu tamanho, como consequência a parede celular se rompe, levando a desnaturação da proteína e a morte da bactéria. Além do mais, são altamente tóxicas para as cepas bacterianas, e sua eficiência é aumentada, pela diminuição do tamanho da partícula (MENOM, et al., 2017; SIDDIQI, et al., 2018; SINGH, et al., 2015).
No entanto, os mecanismos pelos quais AgNPs agem contra bactérias, ainda não estão totalmente elucidadas. Acredita-se que, as nanopartículas de prata interagem com três componentes vitais das células: (a) parede celular de peptidoglicano, (b) membrana citoplasmática, onde as propriedades químicas e físicas são modificadas e resulta num desequilíbrio de osmolalidade, permeabilidade, transporte de elétrons e respiração celular e (c) DNA ribossômico, sítios moleculares de fósforo e enxofre presente nas proteínas, especialmente nas enzimas envolvidas na cadeia de transporte de elétrons. (CAVASSIN, et al., 2015; CHALOUPKA, et al., 2010).
Uma série de metodologias podem ser aplicadas na síntese das AgNPs, porém a síntese biológica destaca-se com uma abordagem alternativa, uma vez que essas rotas apresentam várias vantagens sobre os outros métodos. Também é um fato bem estabelecido que essas rotas são simples, econômicas, ecologicamente corretas e com alto rendimento, além disso, emprega a chamada tecnologia verde, gerando podutos não-tóxicos. As AgNPs produzidas por metodologia biológica, são chamadas de biogênicas (Bio-AgNPs) e utilizam extratos vegetais e/ou micro-organismos, como o fungo Fusarium oxysporum (SIDDIQI; HUSEN; RAO, 2018; VALENTE, et al., 2018).
As Bio-AgNPs agem sinergicamente com antibióticos e são ativas contra muitas bactérias resistentes, podendo apresentar um grande potencial para tratar infecções causadas por bactérias MDR, incluindo A. baumannii (CAVASSIN, et al., 2015; SHIN, PARK, 2017). As vantagens da terapia combinada tem sido propostas por três razões: ampliar o espectro de cobertura antibacteriana, minimizar o aparecimento de resistência a antibióticos atualmente disponíveis, e alcançar efeito sinérgico entre diferentes compostos antimicrobianos (JASIM, et al., 2017; MARCH, BRATOS, 2015). O tratamento eficiente das infecções, através da combinação terapêutica, reduz o tempo de duração e a toxicidade associada aos antibióticos, além de proporcionar uma melhor compreensão (resistência e sinergia), auxiliando os clínicos a desenvolver regimes de dosagens mais eficientes (MARCH, BRATOS, 2015).

3. Metodologia
3.1 OBTENÇÃO DA NANOPARTICULA DE PRATA BIOGÊNICA (Bio-AgNP)
A Bio-AgNP utilizada neste estudo será formulada pelo método descrito por Durán et al. 2005, e adaptada. O método consistirá na redução do nitrato de prata por Fusarium oxysporum estirpe 551 no Laboratório de Genética Molecular de ESALQ-USP (Piracicaba, São Paulo, Brasil). A metodologia de produção das Bio-AgNP foi patenteada (Patent, 2006, PI 0605681-4A2). Brevemente, este fungo será cultivado em placas de Petri de 90 mm em meio contendo 0,5% extrato de levedura (Himedia, Mumbai, Índia), 3% de extrato de malte (Acumedia, Michigan, EUA) e ágar a 1,5% (Kasvi, Itália) a 28°C durante 7 dias. Após o crescimento, a biomassa fúngica será separada no meio de cultura e adicionado a água destilada estéril, 0,1g de micélio para cada 1 ml; será então incubado em um agitador orbital a 28ºC, 150 rpm, por 72 horas. Posteriormente, os componentes serão fracionados por filtração e centrifugação por 5 minutos em 1860 x g. O sobrenadante será misturado com 10 mM AgNO3 (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) e incubado a 28ºC, por 10 dias. As alíquotas de Bio-AgNPs serão medidas por absorvância a 440 nm num espectrofotetro UV-Vis (Varian Cary 50 Probe). O diâmetro das Bio-AgNPs e a medida do potencial zeta serão determinado por espectroscopia de correlação de fótons usando ZetaSizer Nano ZS. O potencial Zeta (mV) da bio-AgNP utilizada neste estudo será -32,9, e o tamanho será de 100 nm.

3.2 ISOLADOS E PREPARAÇÃO DO INÓCULO
Os isolados de A. baumannii multirresistentes utilizados no presente projeto pertencem a bacterioteca do Laboratório de Biologia Molecular de Micro-organismos (LBMM) da Universidade Federal de Pelotas. Serão utilizados 20 isolados multirresistentes, os quais são mantidos congelados (-4ºC) e serão repicados para caldo Brain Heart Infusion (BHI_Kasvi®) e Ágar Mac Conkey (Kasvi®). As suspensões bacterianas serão preparadas em tubos contendo solução salina a 0,9%. A suspensão será homogeneizada por agitação em vortex e medida pela densidade óptica entre 0,08 e 0,1 nm correspondente a escala 0,5 McFarland (1,5 x 108 UFC/mL). O inóculo será preparado com suspensão bacteriana na proporção de 1:20 em caldo Muller Hinton (MH_ Kasvi®).

3.3 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÍNIMA INIBITÓRIA (CIM) DAS Bio-AgNP E DA POLIMIXINA B
O método utilizado para a determinação da atividade antimicrobiana seguirá conforme Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2017). Será utilizada uma placa de microdiluição com 96 poços e acrescentado nos mesmos, 50 µL de meio MH e 50 μL de Bio-AgNP na concentração inicial de 120 µg/mL e, 50 µg do antibiótico Polimixina B, na concentração inicial de 1µg/mL. A microdiluição seguirá a escala 1:2, onde as concentrações irão variar de 120 µg/mL a 0,11 µg/mL Bio-AgNP e de 1 µg/mL a 0,002 µg/mL para a Polimixina B. Após a microdiluição serão adicionados 50 μL do inóculo bacteriano conforme descrito acima. A microplaca será incubada a 37°C durante 24 horas. Após o período de incubação serão acrescentados 20 µL de resazurina 0,02%, que atuará como indicador de viabilidade celular. A CIM será definida como a concentração mínima capaz de inibir o crescimento bacteriano.

3.4 DETERMINAÇÃO DA INTERAÇÃO ENTRE A Bio-AgNP COM A POLIMIXINA B PELO MÉTODO CHECKERBOARD
Após a determinação da CIM, será realizada a combinação da Bio-AgNP com a Polimixina B pelo método de checkerboard. Para cada isolado bacteriano de A. baumannii será utilizada uma microplaca com a associação da Bio-AgNP e da Polimixina B. Serão acrescentados 50µL de meio MH em todos os poços da microplaca e, em seguida, adicionados 50µL da Polimixina B na concentração inicial de 0,375µg/mL e realizada a diluição seriada 1:2. Posteriormente, serão adicionados 50µL da Bio-AgNP na concentração inicial de 30µg/mL e realizadas diluições seriadas 1:2, após serão adicionados 100 µL de inóculo bacteriano. A placa será incubada em estufa a 37°C, durante 24h, e posteriormente acrescentados 20 µL de rezasurina 0,02%, que atuará como indicador de viabilidade celular através de uma reação de oxiredução. A concentração fracional inibitória (CFI) será definida como a menor concentração em que a Bio-AgNP e a Polimixina B em associação serão capazes de inibir o crescimento bacteriano. A interpretação dos resultados do checkerboard será realizada através do índice da concentração fracional inibitória (FICI) obtida pela seguinte fórmula: FICI = (CIM do extrato combinado/ CIM do extrato sozinho) + (CIM do antimicrobiano combinado/CIM do antimicrobiano sozinho). Os resultados do FICI serão interpretados da seguinte forma: FICI ≤ 0,5 = SINERGISMO; 0,5< FICI ≤ 1= ADITIVIDADE; 1< FICI ≤ 2 = INDIFERENÇA e FICI > 2 = ANTAGONISMO. Além disso, o fator modulatório será calculado da seguinte forma: CIM DA POLIMIXINA B SOZINHA / CIM DA POLIMIXINA B EM COMBINAÇÃO COM A Bio-AgNP. O resultado será interpretado: quantas vezes a Bio-AgNP será capaz de reduzir a CIM da polimixina B.

3.5 TESTE DE TEMPO DE MORTE
As curvas de tempo de morte serão determinadas de acordo com o Comitê Nacional para Padrões Laboratoriais Clínicos (NCCLS,1999) para avaliar o efeito da polimixina B e Bio-AgNP na cinética de crescimento de Acinetobacter baumannii. Os isolados bacterianos serão cultivados anteriormente e preparados inóculos correspondente a 0,5 na escala de McFarland e diluídos em MH em proporção de 1: 100. Os compostos serão testados sozinhos e em combinação, de acordo com o ensaio da CIM e CHECKERBOARD, respectivamente, e comparados com o controle positivo bacteriano. Em diferentes momentos de tratamento e incubação (0h, 10min., 20 min., 30 min., 1h, 2h, 4h, 6h, 8h e 24h), serão diluídos as alíquotas da cultura bacteriana e transferidos para uma placa com Ágar Mc Conkey para quantificar o número de células viáveis. Após a incubação da placa de Ágar Mc Conkey a 37ºC por 24 horas, as UFCs serão contadas e uma curva de tempo de morte será construída. O ensaio será realizado em triplicata.


3.6 TESTE DE CITOTOXIDADE EM CÉLULAS VERO
Para a avaliação do efeito citotóxico da polimixina B e Bio-AgNP serão utilizadas células da linhagem Vero, pertencentes ao Laboratório de Virologia e Imunologia da Faculdade de Veterinária da UFPEL. As células serão cultivadas em garrafas adequadas contendo Meio Essencial Mínimo (EMEM) acrescido de soro fetal bovino (SFB), em seguida, as mesmas serão incubadas à temperatura de 37°C. Durante o experimento, o cultivo celular passará pelo processo de tripnização. Em microplacas de poliestireno de 96 cavidades, serão adicionados 100µL de solução, contendo EMEM com SFB a 10% e o cultivo celular (3 x 104 células). As microplacas serão incubadas a 37°C em estufa de CO2 a 5% por 24h. Após a formação do tapete celular, o sobrenadante será desprezado e logo serão realizados os tratamentos. A polimixina B e a Bio-AgNP serão diluídos em EMEM até atingir concentrações de 250µg/mL a 0,0002µg/mL e 120µg/mL a 0,0001µg/mL respectivamente e, de cada concentração, 100µL em triplicata serão transferidos para as cavidades da placa, sobre o tapete celular. Posteriormente ao tratamento, as células permanecerão incubadas sob as mesmas condições por 24h. Em seguida, as placas serão retiradas da estufa e será aplicado o protocolo do reagente 3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo (MTT) para avaliar a viabilidade celular. Após retirar cuidadosamente o sobrenadante das cavidades da microplaca, adicionar 50µL da solução MTT 1mg/mL em cada uma das cavidades, logo, as placas serão incubadas nas mesmas condições por 4h. Transcorrido o período de incubação, os sobrenadantes serão retirados e os sais de formazan serão solubilizados. Em seguida, serão colocados nas cavidades 100µL de dimetilsufóxido (DMSO) por 10 minutos e logo será realizada a leitura das absorbâncias em espectrofotômetro a um comprimento de onda de 540nm (MOSMANN, 1983; PICOLI et al., 2016).

Espera-se encontrar a concentração mínima inibitória (CIM) da Bio-AgNP, bem como da polimixina B, e a possível existência de sinergismo entre elas, frente aos isolados multirresistentes de A. baumannii, visando diminuir a dose terapêutica e com isso a toxicidade das moléculas. Assim, a associação destes dois compostos surge como uma alternativa no tratamento de infecções causadas por A. baumannii multirresistentes.