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Métodos rápidos de diagnóstico, sensíveis e específicos são importantes para o controle de doenças infecto-parasitárias. Neste contexto, testes imunológicos são mais rápidos do que os métodos tradicionais na obtenção dos resultados e de maior facilidade de execução, além de apresentarem melhor sensibilidade e especificidade. O desempenho dos testes imunológicos depende essencialmente da qualidade dos insumos empregados, ou seja, dos anticorpos policlonais (PAbs) ou monoclonais (MAbs), conjugados e antígenos. Em relação aos anticorpos, destacam-se os MAbs, imunoglobulinas secretadas por hibridomas que são obtidas através da fusão celular in vitro de linfócitos B produtores de anticorpos com células de mieloma (Harlow e Lane, 1988). MAbs apresentam elevada especificidade, são facilmente produzidos in vitro e não requerem padronizações a cada lote produzido. Em relação aos antígenos, destacam-se os antígenos recombinantes por conferirem elevada sensibilidade e especificidade aos testes devido à maior concentração de antígeno imunoreativo e ausência de sítios inespecíficos. MAbs e antígenos recombinantes estão entre os produtos biológicos com maior valor de venda do mercado internacional, mantendo assim as empresas que detém a produção e a venda desses insumos líderes do mercado de fármacos biológicos e de produtos biotecnológicos (Aggarwal, 2011).
Dentre os métodos imunológicos para diagnóstico rápido, destacam-se o ensaio imunoenzimático do tipo ELISA e o ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral. O ELISA apresenta, além de rapidez na execução (3 h em média), vantagens como a possibilidade de automação, disponibilidade de reagentes quimicamente estáveis e capacidade de analisar simultaneamente um grande número de amostras (Chaicumpa et al., 1995). Por sua vez, o ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral apresenta operação rápida e simples, com obtenção de resultados imediatos (15 min), baixo custo e o não requerimento de técnicos qualificados ou equipamentos sofisticados e caros (Lin et al., 2010; Zhang et al., 2011). Este método tem sido utilizado para o diagnóstico de muitas doenças contagiosas em humanos e animais e para detecção de moléculas bioativas, hormônios, haptenos, entre outros (Heeschen et al., 1998; Watanabe et al., 2001; Lin et al., 2010).
Diversas estratégias têm sido utilizadas com o objetivo de detectar, em amostras alimentares, ambientais e clínicas, o patógeno alimentar Listeria monocytogenes, o agente causador da listeriose (Lomonaco et al., 2015), uma doença severa que cursa com baixas taxas de morbidade, porém com altas taxas de mortalidade, as quais podem chegar a 30%, causando meningite e septicemia especialmente em grupos de risco, como idosos, crianças, indivíduos imunocomprometidos (Ferreira et al., 2014) e gestantes, as quais também abortam em 20- 30% dos casos (Lamont et al., 2011). A listeriose também tem sido associada a altas perdas econômicas devido ao descarte de alimentos contaminados, a produtividade reduzida das pessoas afetadas, os custos médicos significativos, e as mortes (Hoffmann et al., 2014).
A contaminação por L. monocytogenes ocorre principalmente pelo consumo de alimentos crus e prontos para consumo (Jackson et al., 2018) e a dose infecciosa varia de ~ 102 a 104 bactérias por grama ou mililitro, dependendo da virulência da cepa bacteriana e da suscetibilidade do hospedeiro (McLauchlin, 1990). No Brasil, e provavelmente em muitos outros países em desenvolvimento, a listeriose é subnotificada, principalmente devido à falta de métodos de detecção efetivos, bem como devido à deficiência na coleta de dados epidemiológicos e a falha na comunicação entre hospitais e agências oficiais de vigilância em saúde (Blum-Menezes et al., 2013; Camargo et al., 2017).
O gênero Listeria é atualmente constituído por vinte espécies (Doijad et al., 2015; Leclercq et al., 2019) e 13 sorotipos de L. monocytogenes foram descritos (Radoshevich e Cossart, 2018). Os sorotipos mundiais 1/2a, 1/2b e 4b foram relacionados à maioria dos surtos de listeriose (Cartwright et al., 2013; Kathariou, 2002). Além disso, L. monocytogenes está entre os cinco principais patógenos causadores de gastroenterites, que incluem Salmonella, Toxoplasma, Norovirus e Campylobacter, e representa um desafio para a indústria de alimentos, dada a sua capacidade de se reproduzir em uma ampla variedade de ambientes, incluindo altas concentrações de sal e condições de baixo pH (Gandhi e Chikindas, 2007). Além disso, L. monocytogenes pode sobreviver em uma ampla faixa de temperatura (de 3ºC a 45ºC), é resistente ao congelamento (Tasara e Sthephan, 2016) e pode persistir no ambiente colonizando diferentes tipos de superfície e sobrevivendo através da formação de biofilmes (Kathariou, 2002), sendo, dessa forma, resistente à desidratação, agentes sanitizantes e ações físicas, como a luz ultravioleta (Camargo et al., 2017). Assim, a identificação de L. monocytogenes em amostras de superfície de ambientes de produção de alimentos e lotes de alimentos é importante para evitar surtos de listeriose frequentemente associados a sérias conseqüências econômicas e de saúde (Chaitiemwong et al., 2014).
Os métodos disponíveis para a detecção de Listeria incluem isolamento da bactéria através de cultivo convencional, um método laborioso, demorado e de baixa sensibilidade (Vazquez-Boland et al., 2001), métodos moleculares, baseados na detecção de ácidos nucléicos, como a reação em cadeia da polimerase (Liu et al., 2018), normalmente complexos, de custo elevado, requerendo equipamentos e pessoas treinadas (Wu, 2019; Hudson et al., 2001), e métodos imunológicos, como ELISA e ensaios imunocromatográficos, os quais são considerados mais simples, rápidos e acessíveis (Li et al., 2017; Liu et al., 2017; Bai et al., 2013; Cho et al., 2015; Na et al., 2019; Wu, 2019). Portanto, testes rápidos de diagnóstico para a detecção de L. monocytogenes são de grande valia para reduzir a taxa de mortalidade bem como viabilizar a vigilância epidemiológica desta enfermidade (Schwab et al., 2003).
Existem kits comerciais baseados no ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral ou ELISA para diagnóstico rápido de listeriose, entretanto todos são importados, de custo bastante elevado, têm baixa capacidade de detecção, variando de 1 × 105 a 1 × 106 células/mL (Kitao et al., 2010) e requerem pré-cultivo em meios de cultura específicos para aumentar a quantidade de bactérias a níveis detectáveis, tornando-se demorados e caros (Janzten et al., 2006). Além disso, muitos deles apresentam eficácia duvidosa, provavelmente porque os insumos utilizados são preparados com antígenos ou cepas isoladas em outros países. Assim, o presente estudo tem como objetivo desenvolver e implementar uma plataforma de testes rápidos, específicos e sensíveis (ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral e ELISA) para detecção de L. monocytogenes em alimentos utilizando PAbs e MAbs, e antígenos recombinantes previamente produzidos e caracterizados na Biotecnologia/ CDTec. O teste proposto servirá de base tecnológica para criar a plataforma, que poderá ser empregada no desenvolvimento de métodos rápidos de diagnóstico para outras enfermidades importantes no Brasil.

Cepas e cultivos bacterianos

Serão utilizadas cepas de L. monocytogenes, L. inoccua e outras espécies bacterianas que possuam similaridade genética com a bactéria alvo. Para determinar a concentração de bactérias em UFC/mL a partir da densidade ótica a 600 nm (DO600) dos cultivos de L. monocytogenes, será avaliada a correlação linear (UFC/mL) entre L. monocytogenes e a DO600 do cultivo.

Expressão, purificação e caracterização das proteínas recombinantes de Listeria

Serão utilizadas as proteínas recombinantes rFba e rCodY de Listeria spp. e a proteína rInlA de L. monocytogenes, as quais serão expressas em células competentes de E. coli BL21 (DE3) pLysS e purificadas por cromatografia de afinidade em coluna Hi-Trap (GE Healthcare) carregada com níquel (Ni+2-Sepharose) conforme instruções do fabricante.

Produção em larga escala, purificação e caracterização dos MAbs e PAbs

Serão utilizados na produção dos testes PAbs anti-InlA e anti-InlB de L. monocytogenes (InlB) de camundongo e MAbs produzidos pelo Laboratório de Imunologia Aplicada da UFPel. Os MAbs 2D12 e 3B7 contra a proteína internalina A de L. monocytogenes e o MAb 3F8 que reconhece o gênero Listeria serão utilizados para elaboração do ensaio imunocromatográficode fluxo lateral e ELISA (Mendonça et al., 2012).
A produção em larga escala dos PAbs ocorrerá através de imunizações de camundongos com as respectivas proteínas recombinantes e a produção dos MAbs, através do crescimento dos hibridomas produtores dos MAbs em tumores ascíticos. Para tal, camundongos BALB/c com 6-8 semanas de idade serão utilizados. Os camundongos, procedentes do Biotério Central da UFPel, serão mantidos em gaiolas apropriadas, contendo 5 camundongos por gaiola, em ambiente com temperatura e umidade relativa controladas, e com ciclos de luz e escuridão de 12 h. Todos os animais receberão dieta padrão para roedores e água esterilizada ad libitum.
Para a produção dos MAbs, os animais serão previamente tratados intraperitonealmente com 0,5 mL de Pristane (Sigma). Após 10 dias, 0,5 mL de meio DMEM contendo 5x106 dos hibridomas serão inoculados via intraperitoneal no quadrante abdominal inferior direito com agulha com calibre inferior a 21 G nos camundongos. Entre o 10°-12° dia após a inoculação, os camundongos serão puncionados para a retirada do fluído ascítico, que, em seguida, será centrifugado por 5 min a 1500 g, e o sobrenadante estocado a -20°C até sua purificação para utilização nos experimentos. Todos os procedimentos serão realizados seguindo as Resoluções Normativas do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).
Os PAbs e MAbs serão purificados através de cromatografia de afinidade com colunas de proteína A, de acordo com as instruções do fabricante (Amersham), dializados contra PBS (500 x o volume total das frações) a 4°C por 24 h, concentrados em solução de polietilenoglicol a 20%, visualizados por SDS-PAGE e a suas concentrações determinadas em espectrofotometria por UV. Após purificação, os PAbs e MAbs serão titulados através de ELISA indireto e armazenados a -20°C para futura utilização.

Desenvolvimento e padronização dos protótipos de ELISA

O princípio deste ensaio será detectar a presença de antígenos da bactéria por sua ligação aos MAbs e/ou PAbs, permitindo a discriminação de amostras contendo (positivas) daquelas que não contêm antígenos (negativas) de L. monocytogenes. As concentrações/diluições ideais dos anticorpos adsorvidos na placa (ELISA sanduíche ou de captura), do cultivo, do conjugado enzima-anticorpo e da solução do substrato serão determinadas por titulações de checkerboard de cada reagente contra todos os outros reagentes após a confirmação da melhor escolha de microplacas de reação. Serão avaliados diferentes formatos de ELISA, como ELISA indireto e sanduíche ou de captura.
Para realização do ELISA indireto, placas de poliestireno de 96 cavidades serão sensibilizadas, por 1 h a 37ºC, com 100 µL das bactérias, entre elas L. monocytogenes, L. innocua, e E. coli O157:H7 (DO600 = 1), e com 100 ng por cavidade das proteínas recombinantes rInlA, rFba e rCodY (controles), diluídos em tampão carbonato-bicarbonato (0,05 M, pH 9,6). Formulações de bloqueio, como soluções contendo leite em pó (5%) e albumina sérica bovina (BSA, a 2%) diluídas em PBS, serão avaliadas (100 µL por cavidade), por 1h a 4ºC. Os MAbs diluídos de 1:100 até 1:100.000 serão adicionados nas placas (100 µL/cavidade) e incubados por 1 h a 37°C. Como controles positivo e negativo serão utilizados soro policlonal anti-Listeria e soro pré-imune de camundongos, respectivamente. Como conjugado, será utilizado o anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase diluído em PBS-T. A placa será lavada com PBS-T entre todas as etapas, e a solução cromógena ortofenilenodiamina (OPD) diluída em tampão citrato-fosfato pH 4,0 (0,2M com 0,01% de H2O2) será adicionada. A placa será mantida por 15 min no escuro a temperatura ambiente e a leitura da reação será realizada em espectrofotômetro para microplacas com filtro de 450 nm.
Os MAbs e/ou PAbs serão avaliados também em um ELISA de captura (sanduíche). Para realizar o sanduíche, diferentes formatos e combinações dos MAbs ou PAbs serão testados, como anticorpos de captura e conjugados. Assim, MAbs serão conjugados a enzima peroxidase de acordo com o protocolo descrito por Burns (2004). A diluição e concentração necessária dos PAbs ou MAbs de captura e dos MAbs conjugados serão estabelecidos por ELISA checkerboard. Como controle positivo, um ELISA direto será realizado sensibilizando a placa com a proteína rInlA (200 ng/cavidade) e L. monocytogenes (DO600 = 2). No passo de adição dos MAbs conjugados do ELISA de captura, os mesmos serão adicionados no ELISA direto na mesma concentração. Todos os outros passos serão realizados como anteriormente.

Desenvolvimento e padronização dos protótipos de ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral

O ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral será elaborado em conjunto com Laboratório de Pesquisa em Imunologia da AIDS e da Hanseníase (LIAH) do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade Federal de Goiás (UFG).
As tiras e dispositivos imunocromatográficos serão confeccionados utilizando metodologia descrita e adaptada de Peng et al. (2007). MAbs serão conjugados ao ouro coloidal utilizando metodologia descrita por Gussenhoven et al. (1997) e Snowden e Hommel (1991). O MAb conjugado ao ouro coloidal será aplicado à porção inicial da tira na almofada do captura, para ser utilizado como anticorpo de detecção. Anticorpos anti-Ig de camundongos ou proteína A e outro MAb ou PAb anti-Listeria serão imobilizados na membrana de nitrocelulose como anticorpos de captura nas linhas controle e teste, respectivamente. O XYZ Airjet Dispenser System da BioDot Inc (Irvine, CA, EUA) será usado para depositar o agente de captura na membrana de nitrocelulose e distribuir o conjugado na fibra. Por fim, a membrana montada será cortada em tiras (4 mm de largura) usando o CM4000 BioDot Paper Cutter (Irvine, CA, USA) e armazenadas a 4ºC.
O teste será realizado através da imersão da tira de nitrocelulose pelo lado da almofada de captura em 1 mL de amostra. A leitura dos resultados será realizada visualmente após 15 minutos. Se a amostra contiver a bactéria alvo e/ou antígenos, este reagirá com o MAb conjugado ao ouro coloidal e, o complexo antígeno-MAb-ouro coloidal migrará através da membrana de nitrocelulose por capilaridade, onde reagirá com o outro MAb ou PAb imobilizado na linha teste e formará uma banda colorida. O excesso do complexo ou o MAb conjugado ao ouro coloidal livre, se a amostra não contiver antígenos, migrará através da membrana até a linha controle e será capturado pelo anticorpo anti-Ig de camundongo ou proteína A, formando uma banda colorida. Assim, uma amostra positiva apresentará 2 bandas, uma na linha teste (o que revela a presença da bactéria ou de antígenos da bactéria alvo na amostra testada) e outra na linha controle, enquanto que uma amostra negativa apresentará somente uma banda na linha controle. Resultados serão considerados inválidos se nenhuma banda colorida estiver presente ou se uma banda colorida estiver presente somente na linha teste.

Ensaios com culturas puras e avaliação da sensibilidade e especificidade dos protótipos de ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral e de ELISA

A sensibilidade de detecção dos testes propostos será avaliada a partir de diluições decimais de um cultivo de L. monocytogenes em caldo TSB-YE por 16-18 h a 37º C, cujas concentrações finais (100 a 105 UFC.mL-1) serão confirmadas por contagem em placas, utilizando-se ágar BHI e Oxford. Diferentes tempos de cultivo serão testados (4, 6, 8, 12 e 16 h).
Para avaliar a especificidade do teste, Listeria innocua e outras bactérias serão cultivadas em caldo BHI por 24 h e as diluições e ensaios serão realizados conforme descrito para L. monocytogenes.

Validação dos protótipos de ELISA e de ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral com amostras de alimentos artificialmente e naturalmente contaminadas

Amostras de leite serão contaminadas artificialmente com L. monocytogenes para avaliar a interferência da matriz dos alimentos no desempenho dos testes. Nove diluições seriadas, razão 1: 5 serão usadas como amostra e para determinar as contagens em UFC/mL. As amostras serão testadas diretamente e após um pré-enriquecimento em caldo LEB ou Fraser a 37º C por diferentes tempos de incubação (4, 6, 8, 12 e 16 h), nos sistemas propostos. Posteriormente ao ensaio com alimentos artificialmente contaminados, outros alimentos serão adquiridos do comércio local de Pelotas-RS e avaliados quanto à contaminação natural por L. monocytogenes utilizando os métodos rápidos propostos e a metodologia convencional de cultivo para confirmação e contagem bacteriana.

Metas

1º semestre: Expressão, purificação e caracterização das proteínas recombinantes. Otimização dos cultivos de Listeria spp. e outras bactérias não Listeria usadas no estudo. Treinamento de estudantes.

2º semestre: Produção em larga escala, purificação e caracterização dos MAbs e PAbs. Treinamento de estudantes.

3º e 4º semestre: Desenvolvimento e padronização dos protótipos de ELISA. Conjugação dos MAbs ou PAbs a ouro coloidal. Treinamento de estudantes.

5º e 6º semestre: Confecção das tiras do ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral. Ensaios com culturas puras e avaliação da sensibilidade e especificidade dos protótipos de ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral e de ELISA. Treinamento de estudantes.

7º semestre: Validação dos protótipos de ELISA e de ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral com amostras de alimentos artificialmente contaminados. Treinamento de estudantes.

8º semestre: Validação dos protótipos de ELISA e de ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral com amostras de alimentos naturalmente contaminados. Treinamento de estudantes. Redação de artigos científicos, da patente e do relatório final.

Resultados esperados

O grande impacto deste trabalho ocorrerá na área de métodos imunológicos para o diagnóstico de agentes infecciosos que ainda é incipiente no Brasil. Métodos de diagnóstico rápidos e precisos de listeriose são essenciais para auxiliar profissionais de saúde no controle deste patógeno, visto que os métodos disponíveis são laboriosos, demorados, requerem equipamentos especiais, técnicos treinados, reagentes especiais, laboratórios relativamente sofisticados e apresentam custo elevado. O ELISA e o ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral são métodos que provêem resultados rápidos, não requerem ferramentas sofisticadas ou habilidades especiais e são adequados para a detecção de antígenos ou anticorpos. No entanto, kits baseado nestes métodos para detecção de Listeria são importados e, consequentemente, de custo muito elevado. Assim, o desenvolvimento de produtos nacionais capazes de substituir os importados a um custo mais acessível é necessário. Este projeto também qualificará recursos humanos que servirão de difusores da tecnologia gerada, e os resultados obtidos serão publicados em periódicos científicos e apresentados em congressos. Por fim, este projeto contribuirá para a consolidação de uma das linhas de pesquisa do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGB) da UFPel, diagnóstico de enfermidades, e para o Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Alimentos.

Indicadores de resultados ao final do projeto:

• Desenvolvimento de protótipos de testes rápidos para detecção de L. monocytogenes em alimentos e amostras clínicas;
• Possibilidade de desenvolvimento de plataforma de testes rápidos para diagnóstico de outras enfermidades infecto-parasitárias de interesse ao Brasil;
• Produção de kits de diagnóstico rápido;
• Formação de recursos humanos qualificados;
• Publicações em periódicos nacionais e internacionais indexados;
• Consolidação de um grupo de pesquisa para o desenvolvimento de testes diagnósticos;
• Patente.