Nome do Projeto
Prospecção de uma nova estratégia terapêutica para a comorbidade depressão e déficit cognitivo/doença de Alzheimer utilizando um derivado de quinolina: envolvimento de moléculas de sinalização celular e dos sistemas colinérgico e monoaminérgico
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/07/2020 - 01/07/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A longevidade humana aumentou significativamente ao longo do último século e, com isso, ampliou-se o número de indivíduos que atingem uma idade crítica para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer (DA). Embora a perda de memória seja a principal queixa apresentada pelos indivíduos, em alguns casos, algumas complicações neuropsiquiátricas, como a depressão, são extremamente comuns nos estágios iniciais da DA. Dada a etiologia multifatorial da comorbidade depressão e DA, e ainda, aos efeitos adversos da utilização de medicamentos combinados, moléculas multifuncionais com duas ou mais atividades biológicas complementares podem representar um avanço importante para o tratamento destas doenças. Diante deste contexto, nosso grupo de pesquisa tem buscado moléculas multifuncionais direcionadas ao tratamento de desordens neurodegenerativas e psiquiátricas. Inspirados por essas estratégias de design de drogas, uma das alternativas visa o uso de agentes contento o núcleo quinolina para o tratamento de doenças. O 7-cloro-4-(fenilselanil) quinolina (4-PSQ) tem sido extensivamente estudado por nosso grupo de pesquisa. Anteriormente, foi demonstrado que o 4-PSQ teve efeito em modelos de ansiedade, estresse oxidativo e DA. Além disso, foi evidenciado que esta molécula apresenta uma característica multifuncional, tornando-se uma alternativa promissora para o tratamento da comorbidade depressão e DA. O desafio desta proposta é determinar a atividade terapêutica do 4-PSQ na comorbidade depressão e déficit cognitivo/DA, bem como investigar o envolvimento de moléculas de sinalização celular e dos sistemas colinérgicos e monoaminérgico cerebrais no estabelecimento desta comorbidade. Adicionalmente, pretende-se investigar se o 4-PSQ apresenta efeito antioxidante no tratamento da díade depressão e déficit cognitivo/DA e avaliar a alteração no eixo HPA nos modelos experimentais. Por fim, a toxicidade hepática e renal do 4-PSQ nos diferentes protocolos experimentais será avaliada.

Objetivo Geral

O presente projeto tem por objetivo elucidar o envolvimento de moléculas de sinalização celular e dos sistemas colinérgicos e monoaminérgicos cerebrais no estabelecimento da comorbidade depressão e déficit cognitivo/doença de Alzheimer, bem como determinar a atividade terapêutica de um derivado de quinolina, o 4-PSQ.

Justificativa

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa e sua prevalência tem crescido acentuadamente, estando presente em 3% dos indivíduos entre as idades de 65 e 74 anos, 17% das pessoas na faixa etária de 75 a 84 anos e 32% na população com mais de 85 anos (ALZHEIMER'S ASSOCIATION, 2016, 2018). As manifestações clínicas iniciais da doença são leves, com queixas de perda de memória esporádica e de habilidades cognitivas, que têm pouco ou nenhum impacto na vida diária do paciente (BURNS e ILIFFE, 2009). Entretanto, com o avançar da doença, os lapsos de memória se tornam mais notáveis, sendo detectada por questionamentos repetidos, esquecimento e prejuízo nas atividades diárias dos indivíduos (GUTTMACHER et al., 2003; BURNS e ILIFFE, 2009).
Embora a etiologia da doença de Alzheimer não seja completamente compreendida, ela é considerada uma doença heterogênea e multifatorial, uma vez que vários fatores exercem papéis significativos na sua patogênese (KONRATH et al., 2013; SINGH et al., 2013). As principais características neuropatológicas da doença de Alzheimer incluem o depósito extracelular das placas do peptídeo β-amiloide (βA) nas regiões corticais cerebrais, acompanhado da presença de emaranhados neurofibrilares intracelulares, compostos por proteína tau hiperfosforilada (GLASS et al., 2010; OLSSON et al., 2016).
No entanto, outros fatores podem ser incluídos na etiologia da doença de Alzheimer. Tem sido evidenciado que a perda progressiva de neurônios colinérgicos basais do prosencéfalo é um importante mecanismo que leva à neurodegeneração nesta doença (LU et al., 2013). De fato, uma redução nos níveis de acetilcolina e na atividade da colina acetiltransferase (ChAT) promovem um prejuízo na neurotransmissão colinérgica, contribuindo para a disfunção cognitiva na doença de Alzheimer (SELKOE e SCHENK, 2003; SCHLIEBS, 2005; LU et al., 2013). Adicionalmente, outros mecanismos estudados levam à neurodegeneração, tais como o estresse oxidativo, o aumento na atividade enzimática da isoforma B da monoaminoxidase (MAO-B), a neuroinflamação, as alterações na neuroplasticidade e neurogênese, entre outros (SMITH et al., 2000; ROGERS e LAHIRI, 2004; JOSEPH et al., 2005; LI et al., 2011; CHATURVEDI e FLINT, 2013; LILJA et al., 2013; SCHEDIN-WEISS et al., 2017).
Embora a perda de memória seja a principal queixa apresentada pelos indivíduos, em alguns casos, algumas complicações neuropsiquiátricas, como a depressão, são extremamente comuns nos estágios iniciais da doença de Alzheimer (RITCHIE e LOVESTONE, 2002; ZHAO et al., 2016a,b; GALTS et al., 2019). A depressão é uma importante comorbidade da doença de Alzheimer, sendo a complicação neuropsiquiátrica mais frequente nesta doença, e afetando cerca de 50% dos pacientes (LYKETSOS et al., 2011; HEUN et al., 2013). A depressão pode representar um pródromo para a demência relacionada à doença de Alzheimer em alguns indivíduos (CARACI et al., 2010; WUWONGSE et al., 2010). Além disso, estudos têm demonstrado que a taxa de demência aumenta consideravelmente em pacientes depressivos (KESSING e ANDERSEN, 2004; OWNBY et al., 2006; DINIZ et al., 2013). Dessa forma, existe uma relação direta entre a depressão e a doença de Alzheimer nos pacientes.
Os mecanismos relacionados à díade depressão e doença de Alzheimer não são completamente compreendidos. Tem sido demonstrado uma overdrive do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), promovendo um aumento nos níveis de glicocorticoides em pacientes com depressão e doença de Alzheimer (SIERKSMA et al., 2010). Além disso, algumas moléculas de sinalização celular estão envolvidas na progressão neurodegenerativa da doença de Alzheimer, bem como na comorbidade depressão e doença de Alzheimer. Dentre elas destacam-se a glicogênio sintase quinase-3β (GSK3β), a proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMPc (CREB) e o fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2) (PLÁTENÍK et al., 2014). Outros mecanismos fisiopatológicos comuns na depressão e na doença de Alzheimer incluem o estresse oxidativo, e a alteração da neuroplasticidade e da neurogênese, que envolvem fatores como o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (CARACI et al., 2010; SIERKSMA et al., 2010; MAES et al., 2011).
Adicionalmente, o sistema monoaminérgico tem sido amplamente estudado na comorbidade depressão e doença de Alzheimer. De fato, níveis diminuídos de monoaminas no sistema nervoso central, particularmente em pacientes deprimidos e agressivos com doença de Alzheimer (VERMEIREN et al., 2014), podem desempenhar um papel importante na deterioração da memória e outras funções cognitivas (PALMER e DEKOSKY, 1993; ENGELBORGHS e DE DEYN, 1997).
Na última década, as estratégias de tratamento para a doença de Alzheimer, aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA), foram destinadas, principalmente, em melhorar a neurotransmissão colinérgica no cérebro. Essas abordagens incluem o uso de inibidores da acetilcolinesterase (AChE), tais como a rivastigmina, a donepezila e a galantamina, que promovem uma melhora nos níveis endógenos de acetilcolina no cérebro. Estes medicamentos apresentam uma eficácia moderada como intensificadores cognitivos e não afetam significativamente o processo neurodegenerativo (RACCHI et al., 2004; WEINREB et al., 2016). Assim, uma abordagem alternativa à terapia atual da doença de Alzheimer é a neuroproteção farmacológica de populações neurais seletivas e a promoção da neuroplasticidade e neurogênese (CARACI et al., 2010).
Os fármacos disponíveis para o tratamento da depressão associada à doença de Alzheimer são os mesmos utilizados para tratar a depressão. Entretanto, estudos demonstraram que os antidepressivos clássicos, como os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS), não foram eficazes em reduzir a depressão em pacientes com doença de Alzheimer (BANERJEE et al., 2013; AN et al., 2016; GALTS et al., 2019). Os efeitos adversos dos antidepressivos são somados aos dos fármacos utilizados para o tratamento da doença de Alzheimer, e como consequência ocorre uma redução na qualidade de vida do paciente acometido com esta comorbidade (BANERJEE et al., 2013). Dessa forma, nas próximas décadas, a necessidade de encontrar estratégias efetivas para mitigar a depressão na doença de Alzheimer se tornará uma prioridade, à medida que a população aflita cresce exponencialmente.
Dada a etiologia multifatorial da comorbidade depressão e doença de Alzheimer, e ainda, aos efeitos adversos da utilização de medicamentos combinados, moléculas multifuncionais com duas ou mais atividades biológicas complementares podem representar um avanço importante para o tratamento destas doenças. Diante deste contexto, nosso grupo de pesquisa tem buscado moléculas multifuncionais direcionadas ao tratamento de desordens neurodegenerativas e psiquiátricas. Inspirados por essas estratégias de design de drogas, uma das alternativas visa o uso de agentes contento o núcleo quinolina para o tratamento de doenças. Neste contexto, várias pesquisas demonstram que a fração quinolina é o farmacóforo de muitas drogas anti-doença de Alzheimer, tais como a tacrina, o clioquinol, o azul de metileno, os derivados da berberina e o PMS1339 (FREEMAN e DAWSON, 1991; MANCINO et al., 2009; OZ et al., 2009, JIANG et al., 2011).
Com essa hipótese, o 7-cloro-4-(fenilselanil) quinolina (4-PSQ), um derivado de quinolina contendo um grupo organoselênio, tem sido extensivamente estudado por nosso grupo de pesquisa. Anteriormente, foi demonstrado que o 4-PSQ teve efeito em distúrbios que afetam o sistema nervoso central, tais como a ansiedade (REIS et al., 2017) e o estresse oxidativo cerebral (VOGT et al., 2018). Recentemente, foi evidenciado o efeito anti-doença de Alzheimer em camundongos (PINZ et al; 2018) e a ação em melhorar a memória de ratos envelhecidos (BARTH et al., 2019) deste composto. Importantemente, verificou-se que o 4-PSQ modulou a atividade da AChE e a neuroplasticidade, bem como apresentou efeito antioxidante, evidenciando a característica multifuncional desta molécula (PINZ et al., 2018; BARTH et al., 2019). Adicionalmente, verificou-se que o 4-PSQ apresentou efeito na comorbidade ansiedade e doença de Alzheimer em camundongos (PINZ et al., 2018). Dessa forma, razões importantes persistem para o estudo do efeito do 4-PSQ na comorbidade depressão e déficit cognitivo/doença de Alzheimer.

Metodologia

Síntese do 4-PSQ:
O 4-PSQ será sintetizado no Laboratório de Síntese Orgânica Limpa (LASOL) da UFPel conforme metodologia previamente publicada (DUARTE et al., 2017).

Animais e Aspéctos Éticos:
Para a realização da metodologia proposta neste projeto, serão utilizados camundongos machos Swiss (3 meses e 22 meses) obtidos do Biotério Central da UFPel. Os animais serão mantidos em um ambiente com temperatura e ciclo claro-escuro controlados, recebendo água e ração ad libittum. Serão aplicados critérios rigorosos de ética para minimizar a dor e o sofrimento dos animais. O projeto encontra-se aprovado pela Comissão de Ética e Experimentação Animal da UFPel sob o número CEEA 28008-2019. Todos os experimentos estarão de acordo com o guia do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

Determinação do efeito do 4-PSQ em enzimas dos sistemas monoaminérgico e colinérgico de estruturas cerebrais de roedores, in vitro:
Um aumento na atividade das enzimas MAO-A, MAO-B, e AChE tem sido relatado na depressão e no déficit cognitivo/doença de Alzheimer. Dessa forma, uma estratégia de ação deste estudo é determinar se o 4-PSQ tem efeito inibitório na atividade destas enzimas, a fim de que estes sejam um dos mecanimos da ação farmacológica do composto.
Atividade das enzimas MAO-A e MAO-B: Para avaliar as propriedades inibitórias do 4-PSQ na atividade das enzimas MAO-A e MAO-B, o composto em diferentes concentrações (0,01-500 μM) será incubado juntamente com os homogenatos de córtices cerebrais ou hipocampos de camundongos. A determinação da atividade enzimática será realizada conforme descrito por SOTO-OTERO et al. (2001). A concentração inibitória de 50 % (CI50) do 4-PSQ sobre as enzimas MAO-A e MAO-B será calculada, bem como a inibição máxima (Imáx). A cinética de inibição da atividade da MAO-A e MAO-B será determinada usando diferentes concentrações de quinuramina (1-300 μM) com ou sem a CI50 do 4-PSQ. Os valores de Km (concentração de substrato para que a enzima atinja a metade de sua velocidade máxima) e Vmáx (atividade enzimática na presença de concentrações saturantes de substrato) serão obtidos por regressão não-linear (Michaelis-Menten) e serão usados para analisar o tipo de inibição apresentada pelo 4-PSQ na atividade da MAO-A e MAO-B. A reversibilidade na inibição da atividade da MAO-A e MAO-B pelo 4-PSQ será avaliada usando um método de diálise. As preparações mitocondriais das estruturas cerebrais serão dialisadas juntamente com a selegilina (inibidor seletivo da MAO-B) ou a clorgilina (inibidor seletivo da MAO-A) na ausência ou presença do 4-PSQ (CI50). As alíquotas serão removidas em diferentes intervalos de tempo (0-6 h) para a determinação das atividades da MAO-A e MAO-B.

Atividade da enzima AChE: A fim de verificar o efeito do 4-PSQ na atividade da AChE, o composto, em diferentes concentrações (0,01-500 μM), será incubado juntamente com os homogenatos de córtices cerebrais ou hipocampos de camundongos. A determinação da atividade da AChE será realizada de acordo com o método de ELLMAN et al. (1961), usando o iodeto de acetiltiocolina como o substrato. A cinética de inibição da atividade da AChE será determinada usando diferentes concentrações de acetiltiocolina (0,1-2 mM) com ou sem a CI50 do 4-PSQ. Os valores de Km e Vmáx serão obtidos por regressão não-linear (Michaelis-Menten) e serão usados para analisar o tipo de inibição apresentada pelo 4-PSQ na atividade da AChE. A reversibilidade na inibição da atividade da AChE pelo 4-PSQ será avaliada por diálise. Uma mistura do tecido e tampão fosfato de sódio (100 mM) com ou sem a CI50 do composto será preparada e dialisada sob agitação em 25ºC. As alíquotas serão removidas em diferentes intervalos de tempo (0-60 min) para a determinação da atividade da AChE.

Determinação do efeito tipo-antidepressivo do tratamento subcrônico com 4-PSQ e investigação da ação do composto na comorbidade depressão e déficit cognitivo em um modelo de estresse crônico imprevisível (CUMS - chronic unpredictable mild stress) em roedores:
O modelo do CUMS é amplamente utilizado para causar um comportamento relacionado à depressão. Este modelo consiste na exposição repetida a uma série de estressores leves variáveis e imprevisíveis durante um período de tempo prolongado (ISINGRINI et al., 2010). A utilização deste modelo tem como estratégia de ação determinar se o composto apresentará ação do tipo-antidepressiva, bem como se apresentará efeito na comorbidade depressão e déficit cognitivo.
Os camundongos serão divididos em 10 grupos experimentais: (I) controle, (II) 4-PSQ, (III) donepezila, (IV) moclobemida, (V) selegilina, (VI) CUMS, (VII) 4-PSQ + CUMS, (VIII) donepezila + CUMS, (IX) moclobemida + CUMS e (X) selegilina + CUMS. A donepezila (inibidor da AChE), a moclobemida (inibidor seletivo da MAO-A) e a selegilina (inibidor seletivo da MAO-B) serão utilizados como controle positivo. Os animais pertencentes aos grupos I e VI receberão óleo de canola (10 ml/Kg), os dos grupos II e VII receberão o 4-PSQ (1 mg/Kg), os dos grupos III e VIII receberão a donepezila (1 mg/Kg), aos grupos IV e IX receberão a moclobemida (1 mg/Kg) e aos grupos V e X receberão a selegilina (1 mg/Kg). Todos os tratamentos serão realizados pela via intragástrica através de gavagem do dia 8 ao dia 28 do protocolo experimental.
O protocolo de CUMS será realizado conforme descrito anteriormente (DUCOTTET et al. 2003). Resumidamente, o protocolo de estresse consiste na aplicação variável de estressores. Os estressores serão aleatoriamente programados durante um período de uma semana e repetidos ao longo de 4 semanas do experimento (do dia 1 ao 28 do protocolo experimental). Os animais não estressados serão deixados em repouso em suas gaiolas, sem contato com os grupos estressados. O protocolo de CUMS iniciará no primeiro dia do protocolo experimental, enquanto que os tratamentos iniciarão no oitavo dia. Os estressores serão aplicados diariamente, em horários diferentes todos os dias durante os 28 dias, a fim de minimizar sua previsibilidade.
A partir do 29° dia do protocolo experimental os animais serão submetidos aos testes comportamentais: teste de preferência da sacarose (dias 29 e 30), campo aberto (dia 31), teste do nado forçado (dia 31), teste da suspensão da cauda (dia 32), borrifagem de sacarose (dia 32), labirinto em Y (dia 33) e tarefa da esquiva inibitória (dias 34 e 35). Imediatamente após os testes comportamentais (dia 35), os animais serão submetidos a eutanásia e os córtices cerebrais e hipocampos serão removidos para os experimentos ex vivo: níveis de acetilcolina; atividades das enzimas AChE, ChAT, MAO-A e MAO-B, parâmetros de estresse oxidativo, níveis de BDNF e fator de crescimento nervoso (NGF), níveis de Nrf2 e kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), e níveis de GSK-3β e CREB. Além disso, o sangue será removido para a determinação dos níveis de corticosterona.

Determinação da ação anti-amnésica do 4-PSQ e avaliação do efeito do composto em mitigar a depressão e o déficit cognitivo em um modelo de amnésia em roedores:
A disfunção colinérgica é um dos fatores responsáveis pela amnésia na patofisiologia da doença de Alzheimer (KUMAR et al. 2015). Será utilizado um modelo de amnésia induzida pela injeção de brometo de escopolamina como estratégia de ação para investigar o efeito anti-amnésico do 4-PSQ, bem como a ação do composto na comorbidade depressão e déficit cognitivo. A escopolamina causa amnésia pois é um antagonista colinérgico não seletivo dos receptores muscarínicos (da SILVA et al., 2017; KIM et al., 2018).
Os camundongos serão divididos em 10 grupos experimentais: (I) controle, (II) 4-PSQ, (III) donepezila, (IV) moclobemida, (V) selegilina, (VI) escopolamina, (VII) 4-PSQ + escopolamina, (VIII) donepezila + escopolamina, (IX) moclobemida + escopolamina e (X) selegilina + escopolamina. A donepezila (inibidor da AChE), a moclobemida (inibidor seletivo da MAO-A) e a selegilina (inibidor seletivo da MAO-B) serão utilizados como controle positivo. Os animais pertencentes aos grupos I e VI receberão óleo de canola (10 ml/Kg), aos grupos II e VII receberão o 4-PSQ (1 mg/Kg), aos grupos III e VIII receberão a donepezila (1 mg/Kg), aos grupos IV e IX receberão a moclobemida (1 mg/Kg) e aos grupos V e X receberão a selegilina (1 mg/Kg). Trinta minutos após os tratamentos, os animais dos grupos VI ao X receberão o brometo de escopolamina (0,4 mg/Kg, intraperitoneal) (PAHAYE et al. 2017), enquanto os animais dos grupos I ao V receberão salina (0,9%, 5 ml/Kg, intraperitoneal). Os tratamentos serão realizados diariamente durante um período de 14 dias. Trinta minutos após cada injeção de brometo de escopolamina ou salina, os animais serão submetidos aos testes comportamentais: teste do nado forçado (dia 1), teste da suspensão da cauda (dia 2), borrifagem de sacarose (dia 3), labirinto de Barnes (dias 4 - 8), campo aberto (dias 1, 6 - 8), tarefa do reconhecimento do objeto (dias 9 e 10), tarefa da localização do objeto (dia 10), labirinto em Y (dia 11) e tarefa da esquiva inibitória (dias 12 e 13). No dia 14, os animais serão submetidos a eutanásia e os córtices cerebrais e hipocampos serão removidos para os experimentos ex vivo: níveis de acetilcolina; atividades das enzimas AChE, ChAT, MAO-A e MAO-B, parâmetros de estresse oxidativo, níveis de BDNF e NGF, níveis de Nrf2 e s Keap1, e níveis de GSK-3β e CREB. Além disso, o sangue será removido para a determinação dos níveis de corticosterona.

Determinação da ação do 4-PSQ na díade depressão e doença de Alzheimer em um modelo de doença de Alzheimer em roedores:
O modelo de injeção intracerebroventricular do peptídeo βA é amplamente aceito para o estudo da patofisiologia da doença de Alzheimer, bem como para o screening de agentes anti-doença de Alzheimer. A utilização deste modelo tem como estratégia de ação determinar se o 4-PSQ apresentará efeito na díade depressão e doença de Alzheimer, como uma forma de

Indicadores, Metas e Resultados

Metas: Com este projeto espera-se prospectar uma nova estratégia terapêutica para a comorbidade depressão e déficit cognitivo/doença de Alzheimer utilizando um derivado de quinolina. Adicionalmente, pretende-se elucidar o envolvimento de moléculas de sinalização celular e dos sistemas colinérgico e monoaminérgico na díade depressão e déficit cognitivo/doença de Alzheimer, bem como avaliar se o 4-PSQ modula estes sistemas. Cabe ainda ressaltar que espera-se que a vivência oportunizada pelo projeto contribua para a formação de acadêmicos de graduação e pós-graduação para fazer ciência e produzir inovação científica.
Resultados e impactos esperados: Os resultados deverão estar de acordo com as metas estabelecidas e deverão ser alcançados. Através dos resultados obtidos pretende-se elucidar o envolvimento de moléculas de sinalização celular e dos sistemas colinérgicos e monoaminérgicos cerebrais no estabelecimento da comorbidade depressão e déficit cognitivo/doença de Alzheimer. Ainda, pretende-se prospectar uma nova alternativa terapêutica para esta comorbidade utilizando um derivado de quinolina com propriedades multifuncionais, primando pela inovação científica e tecnológica para atender as demandas da sociedade.
Com o desenvolvimento deste projeto espera-se consolidar e o fortalecer o grupo de pesquisa em Neurobiotecnologia da UFPel, que busca a síntese, a avaliação biológica e toxicológica de moléculas bioativas para diferentes doenças que acometem a população.Além disso, almeja-se envolver alunos de iniciação científica e pós-graduação, gerando trabalhos de conclusão de curso, dissertações e teses relacionadas com o tema. Dessa forma, o projeto também visa contribuir para a formação de recursos humanos na região sul do estado do RS, onde a carência de pessoal qualificado é elevada.
Além disso, almeja-se apresentar os resultados para a comunidade discente e docente de instituições de ensino superior através de palestras, para desta forma divulgar a pesquisa realizada na UFPel, a fim de incentivar novos estudos. Serão apresentados resumos em congressos nacionais e internacionais da área, divulgando os resultados obtidos com este projeto. Por fim, pretende-se também realizar o depósito de patentes e publicar os resultados obtidos em periódicos científicos de abrangência internacional.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CRISTIANE LUCHESE2
DIEGO DA SILVA ALVES1
ETHEL ANTUNES WILHELM4
JULIA VICENTE BIONDI
KARLINE DA COSTA RODRIGUES
NICOLE PAVELAK BECKER
RENATA LEIVAS DE OLIVEIRA

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