Nome do Projeto
Mycobacterium bovis BCG: desenvolvimento de ferrramentas para um microrganismo versátil com aplicação em saúde humana
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/08/2020 - 31/07/2022
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Multidisciplinar
Resumo
A vacina BCG é usada mundialmente contra tuberculose e na imunoterapia de alguns tumores. Cepas de BCG recombinante (rBCG) são construídas para potencializar seu estímulo imunológico e expressar antígenos de diferentes patógenos. Sistemas auxotróficos podem ser usados para rBCG, com vantagens relacionadas à seleção sem antibióticos e ao estímulo prolongado do sistema imune. O desenvolvimento de ferramentas moleculares padronizadas para construção dessas cepas é de suma importância e permitirá que grupos que atuam com enfoque em rBCG, em todo o mundo, possam utilizar as moléculas aqui construídas de maneira reprodutível, permitindo comparação de eficácia entre cepas de rBCG com menor viés. A estratégia de clonagem Biobricks permite essa padronização e já foi descrita pelo nosso grupo para BCG, em um trabalho feito em parceria com a University of Surrey/UK. Assim, este projeto visa desenvolver e caracterizar vetores para cepas de rBCG auxotróficas para leucina (rBCG LeuD).

Objetivo Geral

Desenvolver e caracterizar plasmídeos da série pUP500 para aplicação na construção de cepas de rBCG auxotróficas para o aminoácido leucina (rBCG LeuD), com potencial aplicação vacinal e/ou terapêutica em humanos.

Justificativa

A vacina BCG, uma cepa atenuada de Mycobacterium bovis, é mundialmente usada contra tuberculose (TB) e também empregada como um dos tratamentos contra câncer superficial de bexiga e melanoma metastático. Estudos sugerem que algumas vacinas, como a BCG, tem efeitos inespecíficos sobre o risco de doença e morte por outras causas, devido a mecanismos conhecidos por “trained immunity” e imunidade heteróloga. Considerando o potencial de M. bovis como agente profilático, terapêutico e imunomodulador, estudos tem explorado a construção de cepas recombinantes de BCG (rBCG) que proporcionem maior estímulo imunológico para melhorar sua eficácia contra TB, aumentar seu efeito antitumoral na terapêutica de tumores de bexiga, e expressar antígenos de diferentes patógenos para emprego como vetor vacinal. As cepas de rBCG, em geral, são construídas utilizando gene de resistência a antibiótico como agente seletivo, o qual permite a seleção dos clones recombinantes in vitro. Porém, essa pressão de seleção não é mantida in vivo, podendo levar à perda do plasmídeo contendo as sequências de interesse, e consequentemente, à menor estabilidade da cepa. Isso não é desejável, visto que um de seus objetivos, vacinal e imunoterapêutico, é o estímulo prolongado do sistema imune. Ainda, o uso de genes de resistência a antibiótico não é desejável por questões de biossegurança [8,9]. Assim, cepas auxotróficas de BCG, que possuem deleção de gene essencial para sua sobrevivência, podem ser usadas no desenvolvimento de rBCG. A inserção de um plasmídeo que contenha o gene deletado complementa a mutação, permitindo a sobrevivência do microrganismo, e ainda serve como agente seletivo, substituindo genes de resistência a antibiótico e mantendo a seleção in vivo, o que contribui para maior estabilidade das cepas. A comparação de eficácia entre cepas de rBCG é limitada pela falta de padronização na sua construção. Por isso, nosso grupo desenvolveu uma “caixa de ferramentas”, usando uma estratégia de clonagem molecular nomeada Biobricks, contendo plasmídeos e sequências de interesse para emprego no desenvolvimento de rBCG [12]. Assim, este projeto visa desenvolver e caracterizar vetores Biobricks para a construção de cepas de rBCG auxotróficas para leucina (rBCG LeuD).

Metodologia

Cepas e condições de cultivo
As cepas de Mycobacterium bovis BCG serão cultivadas em caldo 7H9 ou ágar 7H10 com suplementação de OADC além de suplementação com o aminoácido leucina (10 mg/mL) ou com o antibiótico canamicina (50 mg/mL), quando necessário. A cepa de Escherichia coli será cultivada em caldo ou ágar Luria-Bertani à 37°C, com suplementação do antibiótico ampicilina (100 mg/mL), quando necessário.

Clonagem do cassete de expressão contendo gene leuD nos vetores da série pUP500
O cassete de expressão contendo o gene leuD será amplificado a partir do vetor pUP410 através da técnica de PCR, usando primers desenhados com o auxílio do software Vector NTI. Os plasmídeos da série pUP500 contendo apenas promotores micobacterianos ou contendo os promotores clonados upstream do gene repórter gfp serão digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e XbaI e o cassete de expressão LeuD será digerido com a enzima EcoRI e SpeI, seguido de ligação do inserto a cada um dos vetores usando a enzima T4 DNA ligase. Os plasmídeos recombinantes serão nomeados série pUP500/LeuD e serão inseridos em Escherichia coli DH5α através de eletroporação. As células transformadas serão plaqueadas em ágar LB acrescido de canamicina e a seleção dos clones recombinantes será realizada por extração rápida de DNA com fenol-clorofórmio seguido de confirmação por PCR e digestão com enzimas de restrição.

Remoção do gene de resistência a canamicina dos vetores recombinantes
Os clones recombinantes serão cultivados em caldo LB por 18 h à 37 ºC sob agitação de 180 rpm e os plasmídeos recombinantes serão extraídos através de kit comercial. Esses plasmídeos serão digeridos com a enzima de restrição HindIII para remoção do gene de resistência à canamicina e re-ligados com a enzima T4 DNA ligase. Os plasmídeos serão usados para a transformação de M. bovis BCG LeuD como descrito.

Avaliação da funcionalidade das construções usando o gene repórter gfp
Os clones de rBCG LeuD transformados com os plasmídeos da série pUP500/LeuD contendo o gene gfp, serão selecionados e cultivados em caldo 7H9 seletivo por 5-7 dias para monitoramento da expressão do gene repórter GFP através de citometria de fluxo. Os cultivos serão ajustados para a mesma concentração de UFC/mL e analisados utilizando citômetro de fluxo Attune®, azul/violeta (Applied Biosystems). A expressão de eGFP será avaliada em termos de porcentagem de células bacterianas positivas para eGFP do total (células bacterianas com alta fluorescência / células bacterianas com alta + baixa fluorescência) e de intensidade mediana da fluorescência verde entre as células positivas.

Análise estatística
Os níveis de fluorescência serão analisados usando análise unidirecional de variância (ANOVA) seguida pelo pós-teste de Tukey para múltiplas comparações. A significância será considerada para valor de P <0,05.

Indicadores, Metas e Resultados

• Obtenção dos vetores recombinantes pUP500/LeuD e pUP500/LeuD + gfp;
• Obtenção das cepas recombinantes de M. bovis BCG LeuD;
• Caracterização da funcionalidade dos plasmídeos através de monitoramento da fluorescência de GFP por citometria de fluxo.

Impacto Esperado:

A construção de moléculas através da tecnologia BioBricks permite compatibilidade para clonagem de diferentes sequências de interesse e já foi descrita pelo nosso grupo para micobactéria, em um trabalho desenvolvido em parceria com a University of Surrey/UK. Porém, estas ferramentas ainda não estão disponíveis para cepas auxotróficas de BCG. Este projeto permitirá que grupos que desenvolvem pesquisas com enfoque em rBCG, em todo o mundo, possam utilizar as moléculas aqui construídas de maneira padronizada, permitindo comparação de eficácia entre cepas de rBCG com menor viés. Ainda, análises de estabilidade das cepas rBCG auxotróficas são de extrema relevância, uma vez que estão relacionadas com a capacidade de indução de imunidade a longo prazo e, portanto, com a eficácia e viabilidade econômica da vacinação e imunoterapia. Somado à isso, o projeto possibilitará o treinamento e formação de estudantes; a consolidação da área e do grupo, que já atua junto à Graduação em Biotecnologia/UFPel em projetos voltados à popularização da ciência em escolas de Ensino Fundamental e Médio; a publicação de artigos em periódicos internacionais; havendo, ainda, a expectativa de depósito de patente junto ao INPI.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANA CAROLINA KURZ PEDRA
ANDRIELE BONEMANN MADRUGA
FRANCISCO DENIS SOUZA SANTOS
ILANA FIGUEIRA DA SILVA
MARA ANDRADE COLARES MAIA
NATASHA RODRIGUES DE OLIVEIRA
ODIR ANTONIO DELLAGOSTIN1
THAIS LARRÉ OLIVEIRA1
TIFFANY THUROW BUNDE

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