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A leptospirose é uma zoonose de distribuição global, causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira e responsável por aproximadamente 1 milhão de casos anuais e 58 mil mortes em humanos (Costa et al., 2015). É provável que estes números sejam subestimados, pois a leptospirose é uma doença tropical negligenciada, devido a inespecificidade dos sintomas e limitações dos testes diagnósticos (Hotez et al., 2008; Reis et al., 2008). A infecção é contraída através do contato com solo, água ou alimentos contaminados com a urina dos animais portadores da bactéria (principalmente roedores), especialmente em períodos de chuva intensa, e em situações de falta de saneamento básico e superpopulação, as quais favorecem a disseminação da espiroqueta (Adler et al., 2009). Também detecta-se a ocorrência de casos ocupacionais, em trabalhadores rurais, por exemplo, e recreativos, entre praticantes de esportes aquáticos e turismo (Stern et al., 2010).
Atualmente as vacinas disponíveis são bacterinas sorovares específicas, que consistem em isolados locais da bactéria inativada e, por isso não fornecem uma ampla proteção contra a leptospirose. Além disso, as bacterinas geram uma imunidade de curta duração, requerendo reforços anuais, e apresentam uma alta reatogenicidade, sendo permitido o uso humano apenas em poucos países, como China, Cuba, Japão e Vietnã (Dellagostin et al., 2011). O desenvolvimento de uma vacina efetiva contra leptospirose, que proteja contra os diferentes sorovares da bactéria – substituindo as bacterinas existentes - ainda permanece um desafio. Estudos realizados têm demonstrado o potencial de proteínas de membrana externa como alvo para o desenvolvimento de uma vacina leptospiral (Dellagostin et al., 2011).
Proteínas expostas na superfície da bactéria são consideradas como bons alvos vacinais uma vez que anticorpos têm fácil acesso as mesmas. Fatores de virulência que possam ser neutralizados por anticorpos também são bons alvos vacinais. A proteína LigA é expressa somente na superfície da membrana externa de leptospiras patogênicas e apresentam capacidade de ligação à componentes da matriz extracelular (Matsunaga et al., 2003). A proteína LipL32 também apresenta as características supracitadas e é altamente expressa durante a infecção em mamíferos (Haake et al., 2000). A proteína LemA está ancorada à membrana externa com a porção N-terminal no meio extracelular, porém sua exata função ainda não foi identificada (Hartwig et al., 2011). Em um estudo recente realizado pelo nosso grupo foram identificadas, através de abordagem reversa e estrutural, proteínas leptospirais de membrana externa barrilbeta transmembrana que possuem fragmentos TonB-Dependentes conservados e expostos (βb-OMP). As proteínas βb-OMP LIC10896, LIC10964 e LIC12374 possuem alças externas à membrana da leptospira contendo epítopos que podem ser facilmente reconhecidos por anticorpos (Grassmann et al., 2017). A combinação de antígenos pode melhorar a proteção conferida pela vacinação contra leptospirose, de modo a possibilitar uma imunidade esterilizante (Lourdault et.al, 2014; Monaris et.al, 2015).
Mycobacterium bovis BCG é uma vacina viva atenuada mundialmente empregada contra tuberculose, que oferece grande potencial para uso como vetor vacinal contra outros patógenos, por apresentar as características vantajosas de replicar-se em células apresentadoras de antígenos como macrófagos e células dendríticas, sendo eficaz na apresentação de antígenos ao sistema imune do hospedeiro e capaz de conferir proteção de longa duração, induzindo imunidade Th1 e Th2; é estável
e não requer uma cadeia de frio para sua implementação (Ohara et.al, 2001). Além disso, a parede celular de micobactéria é um dos mais fortes adjuvantes imunológicos conhecidos (adjuvante de Freund completo). Todas estas características tornam o BCG extremamente atrativo para o desenvolvimento de um vetor vacinal (Bastos et.al, 2009). As vacinas de BCG recombinante tem sido desenvolvidas desde a década de 90, para expressar antígenos homólogos e heterólogos de vários microrganismos sendo que a entrega destes antígenos, em geral, é feita via plasmídeo ou vetor integrativo utilizando diferentes promotores micobacterianos (Bastos et. al, 2009; Matsuo et. al, 2011; Oliveira et. al, 2017).
A tecnologia de clonagem a ser empregada neste trabalho, nomeada “BioBricks”, consiste em um protocolo simples, onde sequências prefixo (que apresentam sítios para as enzimas de restrição EcoRI e XbaI) e sequências sufixo (sítios Spel e PstI) são projetadas para flanquear as regiões terminais 5' e 3' de uma porção genética, respectivamente. Durante a montagem de quaisquer duas peças BioBricks, a extremidade upstream 3' do fragmento de DNA a ser montado é digerido com Spel e a extremidade downstream 5' é digerida com XbaI. Já que Spel e Xbal produzem extremidades coesivas compatíveis, a ligação das partes a montante e a jusante produz uma região de 8 pb "mista" ou "resíduo" de sequência entre as duas partes, que não é reconhecido por qualquer uma das enzimas. Uma vez obtida a peça composta, essa ainda pode ser novamente digerida com XbaI ou SpeI em etapas subsequentes de montagem. Assim, o mesmo processo, interativo de digestão e de ligação pode ser usado para montar várias peças num sistema biológico sintético (Shetty et al., 2008). Sendo assim o Padrão BioBricks® facilita a clonagem de sequências de DNA compatíveis entre si, de forma padronizada e reprodutível. Diante do exposto, neste projeto pretendemos construir antígenos quiméricos derivados de Leptospira interrogans utilizando a metodologia BioBricks e avaliá-los como vacinas vetorizadas por BCG contra leptospirose em modelo animal de hamster.

- Clonagem das sequências de acordo com o padrão Biobricks
As sequências que serão clonadas de acordo com o padrão BioBricks® no vetor pUP500 serão porções de uma quimera previamente construída composta pelos antígenos LipL32, LemA e LigAni, além de uma quimera composta por porções de proteínas barril beta transmembrana. Cada fragmento será clonado individualmente no vetor pUP500 (plasmídeo que possui origem de replicação em E. coli e micobactéria, sítio de múltipla clonagem compatível com o padrão BioBricks e gene de resistência à canamicina) já contendo o promotor micobacteriano pAN, cuja estabilidade e eficácia para expressão de antígenos heterólogos já foram demonstradas em outros estudos (Bastos et. al, 2009). Os fragmentos serão amplificados por PCR utilizando primers contendo as sequências prefixo (sítios para as enzimas de restrição EcoRI e XbaI) e sufixo (sítios para as enzimas de restrição SpeI e PstI) estabelecidas no padrão BioBricks.

- Clonagem dos fragmentos no vetor pUP500/PpAN
Após a obtenção dos fragmentos descritos acima através da técnica de PCR, estes serão digeridos com as enzimas de restrição XbaI e PstI, e inseridos individualmente no vetor pUP500/PpAN digerido com as enzimas de restrição SpeI e PstI. Desse modo, após a clonagem todos os sítios de enzimas de restrição permanecem na molécula final. Os produtos das reações de ligação serão transformados em Escherichia coli por eletroporação e os plasmídeos recombinantes serão extraídos e caracterizados por PCR e digestão.

- Avaliação da expressão em rBCG
Os seis plasmídeos recombinantes obtidos (pUP500/PpAN:Quimera 2 e pUP500/PpAN:porções 1-5) serão transformados, através de eletroporação, em células competentes de M. bovis BCG Pasteur, para produção das cepas de BCG recombinante (rBCG). As células transformadas serão selecionadas em meio seletivo contendo canamicina e cultivadas em meio líquido para avaliação da expressão por Western blot utilizando os anticorpos policlonais previamente produzidos em camundongos BALB/c.

- Formulações vacinais e imunização de modelo animal
Hamsters (Mesocricetus auratus) machos, com 4-6 semanas de idade, serão aleatoriamente segregados em 7 grupos de 10 animais cada para imunização com as cepas vacinais de rBCG e BCG Pasteur (controle negativo). Os grupos serão imunizados via intraperitoneal nos dias 0 e 21, com
vacinas contendo 106 UFC de rBCG ou BCG Pasteur. Outro grupo contendo 4 animais receberá a vacina bacterina (109 células de L. interrogans sorovar Copenhageni cepa L1-130) e será utilizado como controle positivo. Setenta dias após a primeira dose, os animais serão desafiados com 5 x DL50 de L. interrogans sorovar Copenhageni cepa L1-130. Os animais serão monitorados diariamente para sinais clínicos de leptospirose e animais moribundos serão eutanasiados conforme normas e regulamentos do Comitê de Ética em Experimentação Animal. Os critérios adotados para determinação da eutanásia serão perda de 10% do peso máximo, prostração, pelo eriçado, apatia e falta de apetite. Amostras de sangue periférico serão coletadas através do plexo venoso retro-ocular nos dias 0 (pré-imune), 21 e 70 (pós-imune), utilizando cloridrato de proximetacaína 0,5% como colírio anestésico. Os animais sobreviventes serão eutanasiados aos 28 dias após o desafio. Este experimento será repetido pelo menos uma vez para avaliar a reprodutibilidade dos resultados, sendo necessário um total de 148 animais.

- Avaliação da resposta imune
Será realizada a coleta de tecidos renal, pulmonar e hepático para análises histopatológicas e detecção de leptospiras por imprint. A imunidade esterilizante será avaliada com base no cultivo para reisolamento de leptospiras do tecido renal bem como identificação das mesmas em rim, fígado e pulmão. Para análises histopatológicas, rim, e pulmão serão fixados em formalina 10% tamponada (pH 7.0) e embebidos em parafina. Seções de 5 a 6 μm serão coradas com hematoxilina-eosina para evidenciar nefrite intersticial e hemorragia pulmonar.
A presença ou ausência de leptospiras nas amostras de rins dos animais sobreviventes será avaliada através da cultura e pela técnica de PCR em tempo real quantitativo (qPCR). DNA genômico de leptospira de amostras dos rins será quantificada através de qPCR usando o LightCycler 96 system. As amostras serão preparadas em cortes de 100-200 mg de tecido renal e suspensas em PBS, seguido por homogeneização por dois ciclos de 20 s usando o ribolizador (Hybaid, Kalletal, Germany). O DNA genômico será extraído de aproximadamente 40 mg de tecido usando o kit SV Genomic DNA Purification kit (Promega). As reações serão realizadas em triplicata utilizando o Master Mix GoTaq Probe qPCR (Promega) com os primers e sondas descritas na tabela 3. As condições dos ciclos já estão estabelecidas, sendo a desnaturação inicial a 95°C por 10 min, e 40 ciclos de 15 s a 95°C para desnaturação e 60 s a 60°C para anelamento/extençaõ. O número de leptospiras será determinado em comparação ao número de células de hamsters na amostra quantificado por copias dos genes lipL32 e β-actina respectivamente. Para a cultura, um rim de cada animal sobrevivente será coletado e inoculado em meio EMJH. Durante um período de incubação de oito semanas será utilizado um microscópio de campo escuro para identificar culturas positivas.
A resposta imune humoral será avaliada por ELISA usando as quimeras recombinantes 1 e 2 produzidas em E. coli como antígenos na placa. Brevemente, cada poço será sensibilizado com uma concentração ótima de antígeno, a ser determinada, diluída em tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6) por 16-18 h a 4°C. Soros dos animais serão diluídos 1:100 em PBS-T e incubados por 1 h a 37°C seguido por 3 lavagens com 200 μl de PBST. Anticorpo secundário anti-IgG de hamster conjugado à peroxidase (Sigma; 1:8000) será adicionado e incubado por 1 h a 37°C. A reação será revelada com
dihidrocloreto de o-phenilenediamina (OPD - Sigma-Aldrich) e peróxido de hidrogênio, e parada com a adição de 25 μL de 4 N H2SO4. A absorbância será determinada em leitor de placas em um comprimento de onda de 492 nm.

- Análises estatísticas
Teste de Fisher e de Log-Rank serão usados para determinar significância estatística para mortalidade e sobrevivência, respectivamente. Análise de variância será usada para determinar diferença entre os resultados das outras análises. Valores de P < 0.05 serão considerados estatisticamente significantes.

Obter cepas de BCG Pasteur expressando as cinco porções da quimera 1 e a quimera 2;
Avaliação da resposta imune induzida pelas vacinas em hamsters;
Avaliação do potencial imunoprotetor das vacinas através de desafio homólogo em hamsters;

Este trabalho proporcionará o aumento do conhecimento referente ao desenvolvimento de vacinas vetorizadas por BCG contra a leptospirose, resultando em pelo menos um artigo científico veiculado em periódico de circulação internacional e em resumos divulgados em congressos científicos. Além disso, este projeto possibilitará o treinamento e a qualificação de alunos de graduação e pós-graduação no decorrer dos dois anos de atividades.