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Atualmente grandes são as pressões para que a produção animal seja cada vez mais eficiente (TEDESCHI et al., 2017). Nesse contesto, a nutrição proteica recebe preocupação mais relevante. A excreção de N, especialmente urinária, pode se tornar uma fonte potencial de poluição da água e do ar, a última como N2O, um gás de estufa, ou como pequenos aerossóis de partículas tendo um efeito negativo na qualidade do ar (NRC, 2003). Portanto, além de diminuir os custos de alimentação, melhorar a eficiência da utilização da proteína na produção animal ameniza diretamente a preocupação geral com relação à poluição ambiental.
Grande progresso na nutrição de ruminantes foi alcançado nas últimas décadas no que se refere à determinação das exigências nutricionais de proteína para mantença e produção, bem como à predição do valor proteico dos alimentos pelos sistemas de alimentação NRC (1985, 2000, 2001, 2007, 2016), CNCPS (CANNAS et al., 2004, FOX et al., 2004), CSIRO (2007), AFRC (1993). No entanto, se comparado com espécies não ruminantes, ainda remanescem grandes desafios para que a nutrição proteica dos ruminantes avance mais ainda. Essa dificuldade se deve a complexidade digestiva que os ruminantes possuem, de forma que é complexa a estimativa dos aminoácidos disponíveis para absorção intestinal, sobretudo mediante uma grande variação de combinação de alimentos nas dietas desses animais (OWENS; QI; SAPIENZA, 2014). Já por outro lado, monogástricos possuem sistema digestivo mais simples e dietas com menor variação de ingredientes o que possibilitou chegar a um maior nível de refinamento na estimativa de suas exigências como, por exemplo, baseando-se em aminoácidos essenciais limitantes (SAKOMURA et al., 2014).
Por muito tempo, as exigências proteicas para a formulação de rações dos ruminantes, foram baseadas no teor de proteína bruta dos alimentos, no entanto, o potencial de produção individual dos animais vem aumentando e torna-se cada vez mais importante levar em consideração não só a quantidade de proteína, mas principalmente o perfil de aminoácidos que chega ao intestino para serem absorvidos (SANTOS, 2006). Um dos importantes avanços nutricionais foi à introdução do conceito de proteína metabolizável (PM) que é a totalidade de aminoácidos absorvidos no intestino e serão disponibilizados para as demandas de mantença e produção dos ruminantes (NRC, 2001).
Atualmente conta-se com vários modelos de predição da PM para ruminantes desenvolvidos pelos sistemas de BURROUGHS et al. (1974), Institut National de la Recherche Agronômica (INRA, 1989, 2017), Agricultural Research Council (ARC, 1980), e do National Research Council (NRC, 2000, 2001). Ao observar o banco de dados que foram utilizados para gerar e ou avaliar esses modelos quase que em sua totalidade foram conduzidos utilizando o óxido de cromo como principal indicador de fluxo de digesta. No entanto, não há um marcador ideal e outros marcadores considerados mais precisos, como as terras raras (ex. yttérbio), bem como marcadores de análise menos complexa e igualmente confiáveis, como a fibra em detergente neutro indigestível (FDNi; VALENTE et al., 2011) e até mesmo a fibra em detergente ácido (FDA; KOZLOSKI et al., 2014) vem sendo propostos. A utilização de marcadores de fluxo de digesta é inevitável em experimentos conduzidos para medir a oferta de aminoácidos para os ruminantes e, portanto, é relevante avaliar o grau de precisão e acurácia dos mesmos.
Todos os modelos de predição de PM baseiam-se no conceito de que as proteínas microbianas e de escape ruminal devem ser previstas separadamente e combinadas para estimar a oferta total de PM para o animal. Dessa forma, marcadores microbianos também são utilizados para estimar a fração de aminoácidos proveniente da proteína microbiana, tais como purinas, isótopo estável N15((N15H4)2SO4) e ácido 2,6 – diaminopimélico (DAPA). Grande parte dos modelos dos sistemas supracitados foram desenvolvidos utilizando-se purinas e DAPA como marcadores. No entanto estudos revelam que o DAPA pode superestimar o fluxo de N microbiano no intestino (ILLG; STERN, 1994) e que uso de purinas pode causar viés nesta estimativa (REYNAL; BRODERICK; BEARZI, 2005). Por outro lado, nas últimas décadas estudos de microbiologia ruminal avançaram significativamente com uso de ferramentas como o Real Time PCR quantitativo (RT-PCRq) que permitem analisar de forma mais detalhada e específica às populações microbianas no rúmen (MAO et al., 2015), mas que não foi adequadamente avaliada como ferramenta para estimar o fluxo de aminoácidos de origem microbiana no duodeno.
Com base no que foi abordado, ainda é necessário expender esforços para melhorar a precisão e confiabilidade da estimativa da oferta de proteína microbiana, assim como da oferta total de aminoácidos para ruminantes. Portanto este projeto será conduzido para avaliar metodologias para estimar o fluxo de digesta e de proteína microbiana no duodeno.

O experimento será conduzido nas instalações do Laboratório de Bromatologia e Nutrição de Ruminantes do Departamento de Zootecnia, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). As análises laboratoriais serão realizadas no Laboratório de Bromatologia e Nutrição de Ruminantes do Departamento de Zootecnia, da UFSM e no laboratório de Nutrição Animal da Universidade Federal de Pelotas.

Manejo dos animais e delineamento experimental
Serão utilizados quatro bovinos providos de cânulas ruminal e no duodeno num delineamento de Quadrado Latino 4 x 4 num esquema fatorial 2 x 2, onde serão avaliados dois tipos de volumosos (silagem de milho e feno de Tifton) combinados com duas fontes de suplemento proteico (farelo de soja e grão seco de destilaria (dry distiller grain - DDG)). Cada período experimental terá duração de 16 dias, sendo os 10 primeiros para adaptação e os demais destinados ao período de coleta. Os bovinos receberão deita isoenergéica e isoproteica numa relação volumoso:concentrado de 60:40 que será oferecida diariamente numa proporção de 2% do peso vivo. Os animais serão alimentados duas vezes ao dia, as 08:00h e as 17:00h. O alimento ofertado e sobras serão pesados diariamente e amostras compostas de sobras de cada período experimental por animal serão obtidas.
Serão avaliados comparativamente os seguintes marcadores de fluxo de digesta duodenal: yttérbio, FNDi e FDA. Em todos os tratamentos será utilizado o Cromo-EDTA como marcador da fase líquida. Adicionalmente, será avaliado o efeito dos marcadores microbianos purinas, 15N, e RT-PCR em tempo real na estimativa da proteína metabolizável.

Coletas
Amostras de digesta duodenal serão coletadas 8 vezes ao dia em intervalos de 3 horas nos dias 14, 15 e 16 de cada período, de modo que as amostras tomadas representem um ciclo de alimentação de 24 horas ao longo de 3 dias. O tempo de amostragem será adiantado em1h diariamente para que uma amostra seja obtida para cada intervalo de 1 hora. Serão coletados 100 ml de conteúdo duodenal em cada sub-amostragem. O pH da digesta duodenal será medido e as amostras serão imediatamente congeladas a -20ºC. As amostras serão agrupadas por bovino de forma que se tenha uma amostra composta por animal para cada período experimental.
As amostras de fezes obtidas por coleta total de cada animal do 10º ao 13º dia. Será tomada uma amostra de 10% do total de fezes produzidos diariamente. Todas as amostras serão compostas por animal em cada período e mantidas congeladas a -20°C até posterior secagem e análises.

Administração dos marcadores de fluxo
Cromo-EDTA (BINNERTS et al., 1968), Cloreto de yttérbio (obtido a partir da diluição do óxido de yttérbio em HCl; REYNAL; BRODERICK, 2005), FDNi (HUHTANEN; KAUSTELL; JAAKKOLA, 1994), FDA (KOZLOSKI et al., 2014) e óxido de cromo (Cr2O3) serão usados como marcadores para avaliar o fluxo pós-ruminal da digesta. O Cr-EDTA e YbCl3 serão dissolvidos em água destilada e infundidos no rúmen a taxas diárias constantes de 1 g de cromo e 1,1 g de yttérbio. Os marcadores serão infundidos durante 150 h desde as 09:00h do 11º dia até as 15:00h do 16º dia utilizando uma bomba peristáltica.
O 15N, marcador externo da síntese de proteína microbiana do rúmen no conteúdo duodenal será infundido intraruminalmente em todos os animais do 12º até o 16º dia de cada período experimental. O sulfato de amônio enriquecido com 10% de átomos de 15N ((15NH4)2SO4) será solubilizado e infundido continuamente de maneira que seja fornecido 150 mg de 15N diariamente para cada animal. Antes do início da infusão do 15N, uma amostra do conteúdo ruminal será coletada de cada animal e armazenada a –20ºC para determinação do 15N presente na digesta ruminal antes da infusão do mesmo.

Análises laboratoriais
As amostras serão secas em estufa de ar forçado a 55°C durante 5 a 7 dias e moídas moinho tipo Willey (peneira com porosidade de 1mm) para posterior análise. As amostras de fezes serão secas em estufa de ar forçado a 55º C e moídas em moinho tipo Willey com peneira de 2mm para posterior análise.
Nas amostras de alimento, sobras, conteúdo duodenal e fezes serão determinados os teores de matéria seca (MS) por secagem em estufa a 105ºC e cinzas por queima em mufla a 600ºC durante 3 horas. O teor de matéria orgânica (MO) será calculado como MS – cinzas. O teor de nitrogênio total (N) será determinado pelo método de Kjeldahl (método 984.13, AOAC, 1995).
Nas amostras de alimento, sobras, conteúdo duodenal e fezes, a análise dos teores de fibra em detergente neutro (FDN) será baseada nos procedimentos descritos por Mertens (2002) com uso de α-amilase termoestável, sem sulfito de sódio, exceto que as amostras serão pesadas em saquinhos de poliéster e tratadas com detergente neutro em autoclave a 110 °C durante 40 min (SENGER et al., 2008). O teor de fibra em detergente ácido (FDA) será determinado de acordo com ROBERTSON &VAN SOEST (1981) em sacos de poliéster conforme modificação de KOMAREK (1993).
Para estimar o fluxo duodenal de aminoácidos, cerca de 0,5 g de amostra seca e moída será submetida à hidrólise ácida com 5ml de HCl 6N, em um tubo fechado com tampa de rosca, a 110°C em estufa durante 24horas. Após, o conteúdo será filtrado (filtro de papel de filtração rápida) e o teor de aminoácidos no filtrado será determinado colorimetricamente (PALMER; PETERS, 1969). Na amostra do sobrenadante filtrado do conteúdo duodenal, será analisado o teor de N amoniacal (WEATHERBURN, 1967).
Nas amostras de conteúdo duodenal e fezes, a concentração de Cr-EDTA e yttérbio será quantificada por espectroscopia de absorção atômica após digestão nitro-percórica (WILLIAMS et al., 1962). O marcador interno FDNi nas fezes e conteúdo duodenal será analisado de acordo com (VALENTE et al., 2011).
A mensuração do enriquecimento com átomos de 15N será realizada, utilizando-se espectrofotômetro de massas de reação isotópica. Além disso, nas amostras de conteúdo duodenal serão determinados os teores de purinas (MAKKAR; BECKER, 1999) e RT-PCRq em tempo real para bactérias (MAO et al., 2015) e protozoários (SYLVESTER et al., 2005). A determinação do RT-PCRq será realizada diretamente na amostra de conteúdo duodenal, após extração do DNA, sem necessidade de prévia preparação da amostra (CASTILLO-LOPEZ et al., 2014; MAO et al., 2015).

Cálculos
O fluxo de digesta duodenal (FDD) será calculado da seguinte forma quando utilizado o cromo ou yttérbio como marcador externo:
FDD (g MS/dia) = Dosagem do marcador (g/dia) / Concentração na digesta duodenal (g/g MS)
(1)
O fluxo de digesta duodenal (FDD) será calculado da seguinte forma quando utilizado FDNi e FDA como marcadores internos:
FDD (g MS/dia) = (Excreção fecal (g MS/dia) × Concentração nas fezes (g/g MS)) /
Concentração na digesta duodenal (g/g MS)
(2)
O fluxo de N total será calculado considerando o fluxo de MS duodenal e a porcentagem de N no conteúdo duodenal, da seguinte forma:
N duodenal (g/dia) = (N duodenal (% da MS) × MS duodenal (g/dia) /100 (3)
O fluxo de N amoniacal será calculado de acordo com a relação entre o fluxo de N total, em g/dia, e a porcentagem de N amoniacal, em relação ao N total, respectivamente:
N amoniacal (g/dia) = (N duodenal (g/dia) × N amoniacal (% do N)) /100 (4)
O fluxo de nitrogênio microbiano (NM) será estimado pelo produto entre a concentração de NM (g/g MS) e o fluxo de MS duodenal (g/dia).
O NM no duodeno será estimado com base no fluxo de 15N, purinas e RT-PCR.
O fluxo N residual do alimento será estimado como a diferença entre o fluxo de N total, N amoniacal e N microbiano:
N residual (g/dia) = Nt - NNH3 – NM (5)
A degradabilidade ruminal da proteína (PDR) será estimada pela diferença entre o consumo total diário de N (CN) e o N residual:
PDR (g/dia) = CN – N residual (6)
Assume-se que o N endógeno está incluído no N residual do alimento.

Adicionalmente à avaliação dos indicadores microbianos por meio do experimento proposto, será realizada uma avaliação dos modelos de predição de proteína metabolizável dos sistemas do NRC, CNCPS e AFRC com os valores observados em nosso estudo.

Análise estatística
Para análise do efeito da dieta sobre o marcador de fluxo de digesta, este aninhado ao efeito da dieta, utilizando o 15N como marcador microbiano padrão, os dados serão analisados como modelos mistos utilizando o procedimento MIXED do SAS (v. 9.4 SAS Institute Inc., Cary, NC) conforme o seguinte modelo de parcelas subdivididas:
Yijklm= µ + Ai + Pj + Vk + Cl + VkCl + ɷijkl + Fm + FAmi + FPmj + FVmk + FCml + FVCmkl + ɛijkl
Onde, µ= média geral, Ai= efeito do animal, Pj= efeito do período, Vk= efeito da fonte de volumoso, Cl = efeito da fonte de proteína, ωijk=erro da parcela principal, Fm= efeito do marcador de fluxo duodenal que é uma sub parcela de cada animal, período e tipo de dieta (FAmi + FPmj + FVmk + FCml + FVCmkl) e ɛ=erro associado da sub-parcela. Para a análise do efeito do marcador microbiano também será utilizado o mesmo tipo de modelo matemático.
Diferenças entre médias serão determinadas utilizando-se a opção P-DIFF do comando LSMEANS, a qual diferencia médias baseadas no teste de Fisher, considerando o nível de 5% de significância. Resíduos serão plotados contra os valores preditos para checar as pressuposições do modelo em relação à homocedasticidade, independência e normalidade dos erros. Outliers serão identificados quando os valores do resíduo ‘Studentized’ plotados contra as médias preditas estiverem fora da variação ± 3,0. Se não houver homogeneidade de variância entre os tratamentos, as variâncias serão modeladas pela opção GROUP do comando REPEATED do procedimento MIXED. Adicionalmente, os dados observados nesse estudo serão utilizados para avaliar os modelos dos sistemas de alimentação.

Nesse projeto espera-se encontrar resultados referentes a
1) Definir qual marcador de fluxo duodenal que melhor auxilia na predição da proteína metabolizável.
2) Avaliar se o FDA pode ser utilizado como indicador de fluxo duodenal
3) Desenvolver o método de RT-PCRq para estimativa da proteína microbiana
4) Identificar se o tipo de alimento interfere na estimativa de fluxo de digesta duodenal pelos diferentes marcadores
5) Identificar qual combinação metodológica (marcador de fluxo de digesta duodenal e de microrganismos ruminais) que melhor prediz a proteína metabolizável.
Espera-se que esse projeto seja parte de duas dissertações de mestrado, uma tese de doutorado e quatro iniciações científicas. Devido a maior complexidade de estabelecer a metodologia que envolverá a análise de RT- PCRq nas amostras de digesta duodenal, essa parte do projeto relacionado aos marcadores microbianos será desenvolvida pelo aluno de mestrado, de forma que até o fim do primeiro ano do projeto (fevereiro d 2021) já se tenham sido concluídos as análises laboratoriais dessa parte do projeto. Posteriormente o aluno de mestrado deverá trabalhar nos dados, escrever sua dissertação que deverá de ser defendida entre janeiro-fevereiro de 2022. Além disso, o aluno de mestrado deverá redigir um short comunication ou nota técnica referente à sua dissertação.
Concomitantemente espera-se que o segundo aluno de mestrado e o de doutorado desenvolvam as demais análises referentes aos marcadores de fluxo de digesta duodenal, oferta de proteína metabolizável e avaliação de modelos de modo que sua tese seja defendida em janeiro-fevereiro de 2023.
Adicionalmente reuniões semestrais serão realizadas com toda a equipe do projeto (responsável, colaboradores, alunos responsáveis e estagiários) para esclarecimento de duvidas, apresentação de metas cumpridas e metas para próximo período. Essas reuniões também auxiliarão no desenvolvimento do projeto e tornará a colaboração dos membros do projeto mais efetiva. Além disso a participação periódica da equipe permitirá que as ideias referentes a interpretação dos resultados possam serem amadurecidas em conjunto, o que agregará conhecimento e refletirá na qualidade da execução do projeto.
Além dos artigos finais que serão redigidos para publicação em revistas científicas da área de relevado fator de impacto, também será estimulada a participação em eventos científicos dos alunos de pós-graduação e graduação envolvidos no projeto. Essa apresentação do resultados parciais nos eventos científicos será uma outra forma de avaliar e acompanhar o desenvolvimento deste projeto, bem como verificar a reação da comunidade científica a divulgação dos resultados.