Nome do Projeto
MELHORAMENTO DE ARROZ PARA ESTRESSES ABIÓTICOSINTEGRANDO METODOLOGIAS CONVENCIONAIS, FISIOLÓGICAS E BIOTECNOLÓGICAS
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
11/05/2020 - 12/05/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
Atualmente, o arroz (Oryza sativa L.), é um dos cereais mais cultivados no mundo, ficando atrás apenas do milho. Em nível de produção mundial, o principal produtor é a China, com uma produção de 197,2 milhões de toneladas. O Brasil aparece em 9° lugar, com uma produção de 11,9 milhões de toneladas (FAO, 2013). Na safra 2012/13 a área cultivada no país foi de 2,4 milhões de hectares, com produtividade média de 4,9 t ha-1. O Estado do Rio Grande do Sul é responsável por 67,2% da produção brasileira de arroz irrigado, com produtividade média de 7,5 t ha-1 (IRGA, 2013).
Dentre os fatores ambientais, a salinidade do solo e da água de irrigação, seca, toxidez por ferro e baixa temperatura, são os maiores limitantes para a produção de arroz. O estresse salino, causado, principalmente, pelo acúmulo de cloreto de sódio é um problema para a agricultura em todo o mundo, sendo mais severo nas regiões áridas e semiáridas, onde as elevadas taxas evapo-transpiratórias e as baixas precipitações pluviométricas, associadas ao manejo inadequado do solo e da água, têm contribuído para o surgimento de solos salinizados (ZHU, 2001).
Segundo dados da FAO (2008), aproximadamente 20% das terras cultivadas no mundo vêm enfrentando problemas de salinização. Na região Sul e nas Planícies Costeiras do Rio Grande do Sul, a fonte mais utilizada para irrigação das lavouras é a Laguna dos Patos.
A ocorrência de baixas temperaturas, durante as fases de estabelecimento e/ou na fase reprodutiva do arroz, é um evento climático que tem impacto negativo na produtividade. O problema abrange todo o Estado do RS, sendo mais grave nas regiões Litoral Sul e da Campanha, as quais, historicamente, apresentam maiores frequências de temperaturas baixas, inferiores a 15°C durante a noite, em épocas que coincidem com o estádio reprodutivo do arroz.
Uma estratégia para evitar que o estádio reprodutivo do arroz coincida com ocorrência de temperaturas baixas (fevereiro) é antecipar a época de semeadura da lavoura. Entretanto, com a deposição das sementes no solo ainda frio, a porcentagem e a velocidade da germinação são diminuídas, o período de emergência é prolongado e as plântulas têm seu desenvolvimento reduzido (FAGUNDES, 2010). Assim, para que a prática de semeadura antecipada seja viável, é necessária a utilização de cultivares que possam ser semeadas ainda com solo frio, ou seja, com tolerância nas fases iniciais da planta (germinação).
Além dos estresses por sal e frio, a toxidez por ferro também é um importante estresse abiótico que acarreta sérios distúrbios nutricionais em plantas de arroz, principalmente nos cultivos sob inundação (SOUSA et al., 2004), manejo este responsável por mais de 50% da produção brasileira deste cereal (MAPA, 2013). Assim, o conhecimento do transcriptoma de cultivares de arroz, submetidas a estes tipos de estresses, pode auxiliar a elucidar quais vias metabólicas são ativadas e quais são as principais respostas bioquímicas das plantas em tais condições, permitindo a prospecção de marcadores moleculares que auxiliarão na seleção e obtenção de cultivares com maiores níveis tolerância a estas condições.
Objetivo Geral
Objetivo Geral
Avaliar o genoma e transcriptoma, bem como efetuar a fenotipagem de genótipos brasileiros de arroz na busca de informações sobre os mecanismos de tolerância às alterações climáticas incluindo baixas temperaturas, excesso de sal e toxidez por ferro. O presente trabalho não tem por objetivo o desenvolvimento de novas cultivares, mas sim o desenvolvimento de protocolos de pesquisa.
Objetivos específicos
•Sequenciar os transcriptomas de variedades de arroz com resposta contrastante ao estresse salino, baixa temperatura e toxidez por ferro, cultivados sob condições ótimas e de estresse;
•Identificar genes diferencialmente e igualmente expressos entre os genótipos (tolerantes vs. sensíveis) em resposta a cada um dos tratamentos (NaCl, frio e ferro);
•Comparar os genes que são expressos nas três condições testadas (sal, frio e ferro) e os que são específicos para cada estresse;
•Validar, em PCR em tempo real (qRT-PCR), genes com aumento na expressão ou redução na expressão, identificados no transcriptoma de cada um dos estresses;
•Utilizar ferramentas de bioinformática identificar nos bancos de dados de proteomas de arroz as proteínas referentes os genes/transcritos avaliados nos transcriptomas e/ou estudos de PCR em tempo real (qRT-PCR);
•Classificar, os dados gerados no transcriptoma com base na função molecular e os processos biológicos que estão envolvidos e, a partir destes dados, indicar quais os melhores “genes candidatos” para seleção assistida na tolerância ao estresse por sal, frio e toxidez por ferro em plantas de arroz;
• Anotar e disponibilizar em banco de dados on-line, os dados obtidos a partir das análises realizadas.
Avaliar o genoma e transcriptoma, bem como efetuar a fenotipagem de genótipos brasileiros de arroz na busca de informações sobre os mecanismos de tolerância às alterações climáticas incluindo baixas temperaturas, excesso de sal e toxidez por ferro. O presente trabalho não tem por objetivo o desenvolvimento de novas cultivares, mas sim o desenvolvimento de protocolos de pesquisa.
Objetivos específicos
•Sequenciar os transcriptomas de variedades de arroz com resposta contrastante ao estresse salino, baixa temperatura e toxidez por ferro, cultivados sob condições ótimas e de estresse;
•Identificar genes diferencialmente e igualmente expressos entre os genótipos (tolerantes vs. sensíveis) em resposta a cada um dos tratamentos (NaCl, frio e ferro);
•Comparar os genes que são expressos nas três condições testadas (sal, frio e ferro) e os que são específicos para cada estresse;
•Validar, em PCR em tempo real (qRT-PCR), genes com aumento na expressão ou redução na expressão, identificados no transcriptoma de cada um dos estresses;
•Utilizar ferramentas de bioinformática identificar nos bancos de dados de proteomas de arroz as proteínas referentes os genes/transcritos avaliados nos transcriptomas e/ou estudos de PCR em tempo real (qRT-PCR);
•Classificar, os dados gerados no transcriptoma com base na função molecular e os processos biológicos que estão envolvidos e, a partir destes dados, indicar quais os melhores “genes candidatos” para seleção assistida na tolerância ao estresse por sal, frio e toxidez por ferro em plantas de arroz;
• Anotar e disponibilizar em banco de dados on-line, os dados obtidos a partir das análises realizadas.
Justificativa
Espera-se, a partir da execução deste projeto e com os resultados obtidos:
•Implantação de metodologias eficientes para a identificação de genes envolvidos na tolerância ao estresse salino, baixa temperatura e toxidez por ferro em plantas de arroz;
•Identificação de genes que possam ser utilizados como marcadores para a seleção assistida de genótipos de arroz tolerantes à salinidade, frio e excesso de Fe, auxiliando no complexo trabalho de melhoramento e lançamento de cultivares locais tolerantes a estas condições;
•Contribuir para o conhecimento da fisiologia do estresse salino, frio e toxidez por Fe; •Contribuição para o entendimento de mecanismos adaptativos, através da identificação de rotas metabólicas, associados ao controle dos estresses estudados em plantas de arroz; •Disponibilização de informações genômicas e do transcriptoma, em portal on line, especificamente de genótipos brasileiros, o que possibilitará que os pesquisadores possam ter acesso a proteínas, genes e/ou alelos próprios do germoplasma de arroz nacional. Este fato é de extrema importância, pois, até o presente momento, todos os dados disponíveis são oriundos de dois genótipos estrangeiros (Nipponbare e 9311), os quais podem ser bastante diferentes dos genótipos utilizados nos programas de melhoramento de arroz do Brasil;
•Formação e capacitação de recursos humanos através da elaboração de relatórios de iniciação científica, dissertações de mestrado ou teses de doutorado, de alunos dos Programas de Pós-Graduação envolvidos nesta proposta de trabalho;
•Fortalecimento de parcerias já estabelecidas entre os Programas de Agronomia (Fitomelhoramento) e Pós-Graduação em PPG Fisiologia Vegetal, Biotecnologia da UFPel, PPG Ciências e Tecnologia de Sementes, PPG Ciência e tecnologia Agroindustrial e PPG Sistema Produção Agrícola Familiar;
•Disponibilização das informações obtidas para a comunidade científica, por meio da divulgação dos resultados em congressos, seminários e em importantes eventos técnico-científicos, bem como a publicação dos resultados em periódicos de renomado conceito.
•Implantação de metodologias eficientes para a identificação de genes envolvidos na tolerância ao estresse salino, baixa temperatura e toxidez por ferro em plantas de arroz;
•Identificação de genes que possam ser utilizados como marcadores para a seleção assistida de genótipos de arroz tolerantes à salinidade, frio e excesso de Fe, auxiliando no complexo trabalho de melhoramento e lançamento de cultivares locais tolerantes a estas condições;
•Contribuir para o conhecimento da fisiologia do estresse salino, frio e toxidez por Fe; •Contribuição para o entendimento de mecanismos adaptativos, através da identificação de rotas metabólicas, associados ao controle dos estresses estudados em plantas de arroz; •Disponibilização de informações genômicas e do transcriptoma, em portal on line, especificamente de genótipos brasileiros, o que possibilitará que os pesquisadores possam ter acesso a proteínas, genes e/ou alelos próprios do germoplasma de arroz nacional. Este fato é de extrema importância, pois, até o presente momento, todos os dados disponíveis são oriundos de dois genótipos estrangeiros (Nipponbare e 9311), os quais podem ser bastante diferentes dos genótipos utilizados nos programas de melhoramento de arroz do Brasil;
•Formação e capacitação de recursos humanos através da elaboração de relatórios de iniciação científica, dissertações de mestrado ou teses de doutorado, de alunos dos Programas de Pós-Graduação envolvidos nesta proposta de trabalho;
•Fortalecimento de parcerias já estabelecidas entre os Programas de Agronomia (Fitomelhoramento) e Pós-Graduação em PPG Fisiologia Vegetal, Biotecnologia da UFPel, PPG Ciências e Tecnologia de Sementes, PPG Ciência e tecnologia Agroindustrial e PPG Sistema Produção Agrícola Familiar;
•Disponibilização das informações obtidas para a comunidade científica, por meio da divulgação dos resultados em congressos, seminários e em importantes eventos técnico-científicos, bem como a publicação dos resultados em periódicos de renomado conceito.
Metodologia
Estresse Salino (NaCl)
Serão utilizados dois genótipos tolerantes ao estresse salino (BRS Bojuru e Talento) e dois genótipos caracterizados como sensíveis (BRS Ligeirinho e BRS Pampa).
As sementes serão semeadas em vasos plásticos com capacidade de 2 litros, perfurados na base para garantir a perfeita percolação da água, sendo utilizado como substrato areia previamente lavada com água e ácido clorídrico 1%. As plantas serão cultivadas em casa de vegetação com umidade relativa do ar, temperatura e irrigação diária controladas. A irrigação será alternada entre água e solução nutritiva de Hoagland e Arnon (1938). As plantas serão cultivadas em baldes e quando as plantas atingirem o estádio de desenvolvimento V4, serão mantidas cinco plantas/balde, totalizando 15 plantas/genótipo e a irrigação será realizada, alternadamente, com solução nutritiva e água contendo NaCl na concentração de 100 mM, sendo aplicados 100 mL de solução salina em cada vaso. Serão realizadas duas coletas de tecido vegetal da parte aérea para a extração do RNA total. A primeira coleta será realizada pós 6 horas de exposição ao estresse para a identificação de genes de resposta imediata ao estresse e a segunda coleta após 48 horas de estresse para a detecção de genes de resposta tardia. O experimento será conduzido em delineamento inteiramente ao acaso, com três repetições por tratamento em um esquema fatorial triplo 4 genótipos x duas concentrações de NaCl (0 e 100 Mm) x duas coletas.
Estresse por Frio
Em trabalho utilizara genótipos oriundos de cruzamento entre as cultivares BRS 6–Chui (sensível ao frio - subespécie indica) e e a cultivar ORO (subespécie japonica tolerante ao frio). As sementes serão semeadas em rolos de papel germitest umedecidos com quantidade de água (BRASIL, 2009). As amostras serão germinadas em câmara BOD, sendo adotadas duas condições de germinação: 1) condição normal (25ºC) e 2) condição de estresse (13ºC). A coleta da parte aérea será realizada no estádio S3. O experimento será conduzido em delineamento inteiramente ao acaso em esquema fatorial 12 x 2 (12 indivíduos x 2 temperaturas) com três repetições biológicas por tratamento, sendo cada repetição (rolo de papel germitest) composta por 50 sementes.
Serão utilizados dois genótipos tolerantes ao estresse salino (BRS Bojuru e Talento) e dois genótipos caracterizados como sensíveis (BRS Ligeirinho e BRS Pampa).
As sementes serão semeadas em vasos plásticos com capacidade de 2 litros, perfurados na base para garantir a perfeita percolação da água, sendo utilizado como substrato areia previamente lavada com água e ácido clorídrico 1%. As plantas serão cultivadas em casa de vegetação com umidade relativa do ar, temperatura e irrigação diária controladas. A irrigação será alternada entre água e solução nutritiva de Hoagland e Arnon (1938). As plantas serão cultivadas em baldes e quando as plantas atingirem o estádio de desenvolvimento V4, serão mantidas cinco plantas/balde, totalizando 15 plantas/genótipo e a irrigação será realizada, alternadamente, com solução nutritiva e água contendo NaCl na concentração de 100 mM, sendo aplicados 100 mL de solução salina em cada vaso. Serão realizadas duas coletas de tecido vegetal da parte aérea para a extração do RNA total. A primeira coleta será realizada pós 6 horas de exposição ao estresse para a identificação de genes de resposta imediata ao estresse e a segunda coleta após 48 horas de estresse para a detecção de genes de resposta tardia. O experimento será conduzido em delineamento inteiramente ao acaso, com três repetições por tratamento em um esquema fatorial triplo 4 genótipos x duas concentrações de NaCl (0 e 100 Mm) x duas coletas.
Estresse por Frio
Em trabalho utilizara genótipos oriundos de cruzamento entre as cultivares BRS 6–Chui (sensível ao frio - subespécie indica) e e a cultivar ORO (subespécie japonica tolerante ao frio). As sementes serão semeadas em rolos de papel germitest umedecidos com quantidade de água (BRASIL, 2009). As amostras serão germinadas em câmara BOD, sendo adotadas duas condições de germinação: 1) condição normal (25ºC) e 2) condição de estresse (13ºC). A coleta da parte aérea será realizada no estádio S3. O experimento será conduzido em delineamento inteiramente ao acaso em esquema fatorial 12 x 2 (12 indivíduos x 2 temperaturas) com três repetições biológicas por tratamento, sendo cada repetição (rolo de papel germitest) composta por 50 sementes.
Indicadores, Metas e Resultados
•Estudo, em 36 meses, do transcriptoma e fenótipo de genótipos de arroz, com resposta contrastante ao estresse por sal, frio e toxidez por ferro;
•Aquisição do material de trabalho, estabelecimento dos experimentos, acesso ao RNA total, fita simples (para posterior qRT-PCR) e ds-cDNA das plantas de arroz expostas a cada um dos estresses (NaCl, frio, Fe) no período de 3 meses;
•Envio do ds-cDNA para o sequenciamento e aquisição do transcriptoma de 4 genótipos de arroz expostos ao NaCl, 12 genótipos submetido ao frio e 4 genótipos à toxidez por ferro, ao término de 5 meses;
•Fazer montagem (assembly) dos transcritos, através de duas estratégias: montagem por referência (Reference-based strategy ou ab initio) e montagem de novo, no prazo de 9 meses;
•Obter resultados da expressão diferencial de cada loco (transcrito) entre os grupos de indivíduos de cada estresse, através do programa Bowtie2 ver. 2.0.0, ao término de 12 meses;
•Obter a anotação funcional e descritiva dos transcritos (genes), através do GeneOntology, Blast2GO, BLAST e GIRI REPBASE e Microssatélites (SSR) em 15 meses;
•A partir dos resultados obtidos nos itens anteriores, selecionar, ao menos, 30 “genes candidatos” upregulation, em cada estresse estudado, e desenhar primers para serem validados em qRT-PCR, até os 20 meses;
•Disponibilização, em portal online, dos transcritos e das proteínas “preditas” dos genótipos brasileiros sequenciados neste projeto, no período de 33 meses;
•Redação de relatórios técnicos, durante todo o projeto e relatórios finais, bem como a publicação dos resultados obtidos experimentalmente, no prazo de 36 meses.
•Aquisição do material de trabalho, estabelecimento dos experimentos, acesso ao RNA total, fita simples (para posterior qRT-PCR) e ds-cDNA das plantas de arroz expostas a cada um dos estresses (NaCl, frio, Fe) no período de 3 meses;
•Envio do ds-cDNA para o sequenciamento e aquisição do transcriptoma de 4 genótipos de arroz expostos ao NaCl, 12 genótipos submetido ao frio e 4 genótipos à toxidez por ferro, ao término de 5 meses;
•Fazer montagem (assembly) dos transcritos, através de duas estratégias: montagem por referência (Reference-based strategy ou ab initio) e montagem de novo, no prazo de 9 meses;
•Obter resultados da expressão diferencial de cada loco (transcrito) entre os grupos de indivíduos de cada estresse, através do programa Bowtie2 ver. 2.0.0, ao término de 12 meses;
•Obter a anotação funcional e descritiva dos transcritos (genes), através do GeneOntology, Blast2GO, BLAST e GIRI REPBASE e Microssatélites (SSR) em 15 meses;
•A partir dos resultados obtidos nos itens anteriores, selecionar, ao menos, 30 “genes candidatos” upregulation, em cada estresse estudado, e desenhar primers para serem validados em qRT-PCR, até os 20 meses;
•Disponibilização, em portal online, dos transcritos e das proteínas “preditas” dos genótipos brasileiros sequenciados neste projeto, no período de 33 meses;
•Redação de relatórios técnicos, durante todo o projeto e relatórios finais, bem como a publicação dos resultados obtidos experimentalmente, no prazo de 36 meses.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| AMANDA VALENTINI BASEGGIO | |||
| ANDRÉS ELOY CHACÓN ORTIZ | |||
| ANTONIO COSTA DE OLIVEIRA | 1 | ||
| CAMILA PEGORARO | 1 | ||
| DIANA MARCELA HERNANDÉZ HERNÁNDEZ | |||
| EDUARDO VENSKE | |||
| ELIANE LIMA DE AQUINO | |||
| EUGENIA JACIRA BOLACEL BRAGA | 1 | ||
| Flávia Lopes Solari | |||
| JOSIANE VARGAS DE OLIVEIRA MAXIMINO | |||
| JULIANA NUNES MARQUES DIAS | |||
| JÉDER DA ROCHA MATTOS | |||
| LATÓIA EDUARDA MALTZAHN | |||
| LUCIANO CARLOS DA MAIA | 4 | ||
| LUCIANO DA SILVA PINTO | 1 | ||
| LUIS HERMINIO CHAIREZ TEJEDA | |||
| PEDRO AUGUSTO SALGUEIRO DONATO BACELAR | |||
| RAYMOND JOSEPH | |||
| ROGERIO OLIVEIRA DE SOUSA | 1 | ||
| SILVANA ALVES ROSA | |||
| STEFÂNIA GARCIA ZENKER | |||
| VICTORIA FREITAS DE OLIVEIRA | |||
| VINICIUS FARIAS CAMPOS | 1 | ||
| WINDER FELIPEZ CHIRI |