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Mesmo que existam no mercado brasileiro antiparasitários similares e com eficácia inicialmente comprovada, os mesmos se restringem a princípios ativos já conhecidos, com espectros de ação específicos/limitados e com necessidade de doses repetidas. Portando, considerando o ineditismo de um produto veterinário contendo um fármaco até então utilizado apenas em humanos, que pode ser usado em dose única, com potenciais benefícios para a saúde pública, o presente projeto tem sob este aspecto um caráter altamente inovador e com grande potencial de impacto mercadológico.

As metodologias a serem empregadas para o uso da molécula serão baseadas nos princípios de investigação da toxicidade e avaliação da eficácia da nitazoxanida, com estudos in vitro (atividade e citotoxicidade) e ex vivo (teste em olho de frango). Esta série de estudos faz-se estritamente necessária, quando deseja-se incorporar uma nova alternativa de tratamento ou até mesmo uma nova molécula ao compêndio de medicamentos disponíveis para determinada finalidade. Primariamente os testes de eficácia irão verificar se o produto possui capacidade de bloqueio ou interrupção da mantença dos parasitos para posteriormente seguir com os testes de toxicidade aonde será analisado possível grau de toxicidade em células eucariotas (Fase I). Os testes de toxicidade e de eficácia in vitro, serão realizados em concordância com o protocolo de minimização de utilização de animais imputado pelas agências internacionais: Comitê Inter-agência de coordenação e validação de métodos alternativos (ICCVAM), Centro Europeu de Validação de Métodos Alternativos (ECVAM) e o Centro Japonês de Validação de Métodos Alternativos (JaCVAM). Para avaliação da eficácia in vitro será utilizado o teste modificado de filtragem e recuperação de ovos segundo MINHO et al. (2015). Para a técnica, será utilizada uma alíquota filtrada e purificada de 100 a 150 ovos e ooscistos/μL, quantificada através da técnica de Mini Flotac®, obtida através de uma amostra coprológica infestada. As amostras serão submetidas a teste com um antihelmíntico reconhecido por sua eficácia e de largo uso no mercado veterinário, como controle positivo e a molécula nitazoxanida em diversas concentrações variando de 30 mg/Kg a 150 mg/ kg (SOTO et al., 2017) isolado ou em associações com moléculas de largo uso na medicina veterinária que possam amplificar seu espectro de ação como Ivermectina, pirantel e febantel. Após 24h será realizada a avaliação parcial da eficácia com a contagem total de estruturas em 48h. Serão contadas todas as estruturas (ovos, oocistos e larvas de primeiro estágio – L1) para obtenção da estimativa de eclodibilidade dos ovos bem como de eficácia dos produtos testados. Para obtenção da porcentagem de eficácia será realizado o cálculo a seguir: PERCENTUAL DE EFICÁCIA (%): (L1/(ovos+L1)) X 100
Para a avaliação da toxicidade in vitro, serão incubadas células da linhagem CRIB, MDCK e MDBK em placas de 96 poços, em estufa a 37 ºC e 5% CO2 por 24h. Ao fim deste período, os meios serão aspirados e adicionados a concentrações seriadas de nitazoxanida. O controle utilizado será DMSO na dose de 1:200. Após as placas serão acondicionadas novamente em estufa a 37 ºC e 5% CO2 por 72 h. Ao término das 72h, os tratamentos de cada poço serão aspirados e 50 μL de solução de brometo de [3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MMT) será adicionado individualmente por poço com posterior incubação por 4h, para que ocorra redução do MTT. O meio será então desprezado com adição de 50 μL de álcool etílico e posterior incubação por 10 minutos. Será procedida a leitura e a viabilidade celular calculada pela fórmula: média da absorbância dos tratados / média dos controles x100. A análise de hemotoxicidade será realizada com cultivos de linhagens leucocitárias de cães e gatos submetidas a exposição as diluições de nitazoxanida, com posterior avaliação através de contagem em câmara de Neubauer a concentração final de células sendo a média estipulada com base no número obtido no controle celular. As análises serão realizadas em 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas pós realização da inoculação.
Será também realizado o teste em olho de frango ex vivo (Chicken Enucleated Eye Test), serão utilizados olhos de frangos adultos (destinadas previamente ao consumo) dissecados, conservados em temperatura de 18 a 25 ºC, no máximo duas horas pós coleta. O teste de irritabilidade ocular será realizado seguindo a diretriz do OECD - Guideline for the Testing of Chemicals - Isolated Chicken Eye Test – normativa 43814. Para realização do ensaio de irritabilidade ocular serão utilizados grupos controles negativo com utilização de solução fisiológica (NaCl 0,9%), controle positivo (ácido acético 10%) e os grupos tratamentos baseados em concentrações isoladas da nitazoxanida isolada ou em associações. A avaliação de ausência ou presença de irritabilidade ocular considerará parâmetros de retenção de fluoresceína sódica, opacidade de córnea e inchaço de córnea.
Através do teste de Shapiro-Wilk será realizada a análise de normalidade para todas as variáveis contínuas. Após, para as variáveis contínuas normais, será realizada análise de variância com posterior comparação entre as médias através do teste de Tukey. Quando as variáveis não apresentarem distribuição normal, será realizada a análise de variância para médias não paramétricas de Kruskal-Wallis. Variáveis categóricas serão analisadas por teste T, quando aplicável. Todas as análises serão realizadas no software GraphPad 6.0.

- Eficácia da molécula Nitazoxanida como agente protozoaricida; - Eficácia da molécula Nitazoxanida como agente nematodicida; - Eficácia da molécula Nitazoxanida como agente trematodicida; - Desenvolvimento de um produto contendo Nitazoxanida para uso em cães e gatos.