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A leptospirose é uma importante zoonose de distribuição global, reemergente e subnotificada, especialmente nos países subdesenvolvidos e de clima tropical (Ko et al., 2009; Pereira et al., 2017). Estima-se que anualmente a doença acometa em torno de 1,03 milhões de pessoas, acarretando em 58,900 mortes (Costa et al., 2015). O gênero subdivide-se, além de espécies saprofíticas e intermediárias, em 17 espécies patogênicas e mais de 300 sorovares, dos quais mais de 260 são classificados como patogênicos e aptos a causar infecção em uma variedade de espécies animais (Adler and Moctezuma, 2010; Vincent et al., 2019).
A infecção é mantida pela persistente colonização dos túbulos renais proximais permitindo com que animais domésticos, especialmente pequenos roedores, além de cães, bovinos, suínos, equinos e animais silvestres ajam como importantes reservatórios de leptospiras em zonas urbanas e rurais (Adler and Moctezuma, 2010; Bharti et al., 2003). Humanos são hospedeiros acidentais e sua infecção ocorre usualmente através do contato direto com a urina de animais portadores de leptospiras patogênicas ou de forma indireta pelo contato com solo e água contaminados (Bharti et al., 2003; Haake and Levett, 2015). Os fatores de risco para a infecção em humanos incluem exposições ocupacionais e recreativas, contato com águas de enchentes e viagens para áreas endêmicas, como países tropicais em desenvolvimento (Haake and Levett, 2015).
Além da preocupação com o impacto na saúde pública, a leptospirose também é responsável por gerar significativas perdas econômicas no setor de pecuária, especialmente em espécies produtoras de alimentos como a carne e o leite, ou ainda de produtos de interesse industrial (Pereira et al., 2017). Nestes animais, a doença esta associada a ocorrência de problemas reprodutivos como retenção de placenta, abortos, nascimento de animais prematuros, natimortos ou fracos e queda da produção leiteira (Adler and Moctezuma, 2010; Pimenta et al., 2018).
A medida de controle mais efetiva para a leptospirose baseia-se na vacinação. As vacinas comercialmente disponíveis consistem em preparações de células inteiras inativadas (bacterinas) (Verma et al., 2013). Estas vacinas são mundialmente aplicadas em cães, bovinos, suínos e equinos, entretanto induzem imunidade somente contra sorovares antigenicamente relacionados àqueles presentes na formulação vacinal e proteção de curta duração, requerendo reforços semestrais (Adler and Moctezuma, 2010; Haake and Levett, 2015). Além disso, estas vacinas podem causar efeitos colaterais locais e generalizados como dor de cabeça, dor muscular, febre e vômito, o que associada às outras limitações descritas acima, limitam sua aplicação em humanos, estando restrita a populações de risco de alguns poucos países altamente endêmicos para a doença (Haake and Levett, 2015; Verma et al., 2013; Xu and Ye, 2018).
No setor veterinário, a eficácia das bacterinas tem sido questionada. Entre os principais problemas relatados estão a baixa indução de anticorpos protetores em bovinos e suínos, bem como imunidade de curta duração e falha na prevenção da colonização renal e excreção urinária (Fávero et al., 2018; Sonada et al., 2018). A qualidade dos antígenos incluídos nas composições das bacterinas é um importante fator que pode afetar a eficácia destas vacinas (Martins et al., 2018). Sabe-se que a virulência de cepas de leptospiras patogênicas diminui após 3-6 passagens in vitro (Johnson and Harris, 1967; Xu and Ye, 2018). Logo, o estabelecimento de um controle de qualidade da imunogenicidade das vacinas requer a manutenção de cepas virulentas para sua produção. No entanto, o processo de produção industrial de vacinas geralmente utiliza cepas padrão com contínuas passagens in vitro. Este processo ocasionalmente acarreta na perda da virulência destas cepas, devido a alterações na integridade e na conformação dos determinantes antigênicos expostos na superfície da bactéria (Martins et al., 2018).
Atualmente, são escassas as informações disponíveis a respeito da proteção induzida por bacterinas compostas por sorovares virulentos em sua formulação. Logo, as inconsistências relatadas a respeito da eficácia das bacterinas (Fávero et al., 2018; Martins et al., 2018; Sonada et al., 2018) podem estar associadas à perda/redução da sua imunogenicidade, comprometendo o estimulo de uma resposta imune eficaz.

Obtenção e cultivo das cepas
Cepas virulentas de L. interrogans sorovares Canicola e Pomona e cepas avirulentas dos sorovares Canicola, Copenhageni e Pomona serão fornecidas pela empresa Ourofino Saúde Animal, através de acordo de cooperação. A cepa virulenta L. interrogans sorovar Copenhageni L1-130, é a cepa padrão utilizada para os estudos em leptospirose e será obtida do banco de cepas do Laboratório de Vacinologia do Centro de Desenvolvimento Tecnológico da Universidade Federal de Pelotas. Todas as cepas serão cultivadas em meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (Difco; BD, Brasil) líquido enriquecido com 10% de suplemento comercial (Difco, BD, Brasil) a 30 °C. As cepas virulentas serão estocadas em nitrogênio líquido (com 2,5% de DMSO) até o momento do uso.
Determinação das doses letais para 50% (DL50) dos animais
infectados com espécies patogênicas de Leptospira sp.
A avaliação das doses letais para 50% (DL50) das cepas Canicola, Copenhageni e Pomona será realizada em hamsters da espécie Mesocricetus auratus linhagem Golden Syrian, fêmeas e machos, com 8-12 semanas de idade. As doses letais serão calculadas pela fórmula de Reed and Muench (1938). Serão utilizados três animais por grupo e estes serão inoculados via intraperitoneal com 1 mL de cada uma das diluições de 108, 106, 104, 102 e 10 leptospiras/mL em PBS-1X no dia 0 do experimento.
Os animais infectados serão monitorados diariamente durante 28 dias. Animais com sinais clínicos de leptospirose e moribundos serão eutanasiados conforme normas e regulamentos do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA. Os critérios utilizados para determinar o momento da eutanásia serão: perda de 10% do peso máximo, prostração, pelo eriçado, apatia, falta de apetite, hematúria, uveíte e hemorragia. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados de acordo com as normas internacionais e em consonância com os princípios éticos de experimentação animal do CONCEA. Todos os procedimentos descritos envolvendo experimentação animal foram submetidos à aprovação pelo Comitê de Ética da UFPel (CEEA 6273-2020).
Preparo das bacterinas
Para o preparo das bacterinas, será realizada a contagem de células viáveis das culturas dos sorovares Canicola, Copenhageni e Pomona virulentos e avirulentos utilizando câmara de Petroff-Hausser (Thomas Scientific®). As culturas com densidade celular de aproximadamente ~1× 108 células/mL serão centrifugadas 12.000 rpm × 10 min e lavadas duas vezes com PBS-1X estéril. A concentração das células será ajustada para obtenção de 108 células/dose de vacina, seguida de inativação física por calor (56 °C por 20 min) ou química por adição de formaldeído. As vacinas serão estocadas a -20 °C até o momento do uso.
Avaliação da eficácia das bacterinas em hamsters
Para análise da eficácia das vacinas serão utilizados hamsters Golden Syrian (Mesocricetus auratus) fêmeas e machos, com 6-8 semanas de idade, procedentes do Biotério Central da UFPel. O experimento será realizado em quatro etapas.
Etapa 1 – Vacinação dos animais com uma dose de cada bacterina compostas pelos sorovares supracitados virulentos X vacinas compostas pelos mesmos sorovares avirulentos frente a desafio homólogo com as respectivas cepas;
Etapa 2 – Vacinação dos animais com duas doses de cada bacterina compostas pelos sorovares supracitados virulentos X vacinas compostas pelos mesmos sorovares avirulentos frente a desafio homólogo com as respectivas cepas;
Etapa 3 – Vacinação dos animais com uma dose de cada bacterina compostas pelos sorovares supra citados virulentos X vacinas compostas pelos mesmos sorovares avirulentos frente a desafio heterólogo;
Etapa 4 – Vacinação dos animais com duas doses de cada bacterina compostas pelos sorovares supra citados virulentos X vacinas compostas pelos mesmos sorovares avirulentos frente a desafio heterólogo.
Para o experimento 1, os animais serão identificados individualmente e então serão divididos aleatoriamente em nove grupos de oito animais cada, totalizando 72 animais conforme descrito na Tabela 2.
Tabela 2 – Vacinação em hamsters com uma dose de bacterinas compostas por sorovares virulentos e avirulentos frente a desafio homólogo.
Grupos Vacina
A Bac Avirulenta Canicola
B Bac Virulenta Canicola
C PBS 1
D Bac Avirulenta Pomona
E Bac Virulenta Pomona
F PBS 2
G Bac Avirulenta L1-130
H Bac Virulenta L1-130
I PBS 3
Para o experimento 2, os animais serão identificados individualmente e então serão divididos aleatoriamente em nove grupos de oito animais cada, totalizando 72 animais conforme descrito na Tabela 3.
Tabela 3 – Vacinação em hamsters com duas doses de bacterinas compostas por sorovares virulentos e avirulentos frente a desafio homólogo.
Grupos Vacina
A Bac Avirulenta Canicola
B Bac Virulenta Canicola
C PBS 1
D Bac Avirulenta Pomona
E Bac Virulenta Pomona
F PBS 2
G Bac Avirulenta L1-130
H Bac Virulenta L1-130
I PBS 3
Para o experimento 3, os animais serão identificados individualmente e então serão divididos aleatoriamente em quinze grupos de oito animais cada, totalizando 120 animais conforme descrito na Tabela 4.
Tabela 4 – Vacinação em hamsters com uma dose de bacterinas compostas por sorovares virulentos e avirulentos frente a desafio heterólogo.

Grupos Vacina Desafio
A Bac Avirulenta Canicola 100XDL50 Pomona
B Bac Virulenta Canicola 100XDL50 Pomona
C PBS 1 100XDL50 Pomona
D Bac Avirulenta Canicola 100XDL50 L1-130
E Bac Virulenta Canicola 100XDL50 L1-130
F PBS 2 100XDL50 L1-130
G Bac Avirulenta Pomona 100XDL50 L1-130
H Bac Virulenta Pomona 100XDL50 L1-130
I Bac Avirulenta Pomona 10XDL50 Canicola
J Bac Virulenta Pomona 100XDL50 Canicola
K PBS 3 100XDL50 Canicola
L Bac Avirulenta L1-130 10XDL50 Canicola
M Bac Virulenta L1-130 10XDL50 Canicola
N Bac Avirulenta L1-130 100XDL50 Pomona
O Bac Virulenta L1-130 100XDL50 Pomona

Para o experimento 4, os animais serão identificados individualmente e então serão divididos aleatoriamente em quinze grupos de oito animais cada, totalizando 120 animais conforme descrito na Tabela 5.
Tabela 5 – Vacinação em hamsters com duas doses de bacterinas compostas por sorovares virulentos e avirulentos frente a desafio heterólogo.

Grupos Vacina Desafio
A Bac avirulenta Canicola 100XDL50 Pomona
B Bac virulenta Canicola 100XDL50 Pomona
C PBS 1 100XDL50 Pomona
D Bac avirulenta Canicola 100XDL50 L1-130
E Bac virulenta Canicola 100XDL50 L1-130
F PBS 2 100XDL50 L1-130
G Bac avirulenta Pomona 100XDL50 L1-130
H Bac virulenta Pomona 100XDL50 L1-130
I Bac avirulenta Pomona 10XDL50 Canicola
J Bac virulenta Pomona 10XDL50 Canicola
K PBS 3 10XDL50 Canicola
L Bac avirulenta L1-130 10XDL50 Canicola
M Bac virulenta L1-130 10XDL50 Canicola
N Bac avirulenta L1-130 100XDL50 Pomona
O Bac virulenta L1-130 100XDL50 Pomona

Em todos os experimentos os animais receberão uma ou duas doses de 0,1 mL de cada formulação vacinal administradas por via intramulscular com um intervalo de 14/21 dias. Amostras de sangue serão coletadas através da punção da veia de maior calibre entre os dentes incisivos inferiores nos dias 0 (pré-vacinação), 14 e 21/28 pós-vacinação. Antes de realizar a coleta de sangue os animais serão submetidos a leve anestesia com isoflurano. O soro será separado por centrifugação e armazenado à -20 °C até a sua utilização.
Após a última coleta de sangue (dia 14 ou 21/28 pós-primeira imunização) os animais serão desafiados com inóculo letal de L. interrogans sorovares Copenhageni cepa L1-130, Canicola capa LO4 ou Pomona e monitorados diariamente durante 28 dias. Animais com sinais clínicos de leptospirose e moribundos serão eutanasiados conforme normas e regulamentos do CONCEA. Os critérios utilizados para determinar o momento da eutanásia serão: perda de 10% do peso máximo, prostração, pelo eriçado, apatia, falta de apetite, hematúria, uveíte e hemorragia. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados de acordo com as normas internacionais e em consonância com os princípios éticos de experimentação animal do CONCEA.
A eficácia da vacina será determinada pelo número de animais sobreviventes ao desafio, quando comparado ao grupo controle. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados e necropsiados, e posteriormente congelados e entregues ao Biotério Central da UFPel, que os encaminha para incineração.
Avaliação da resposta imune induzida em hamsters
A resposta imune humoral será avaliada por ELISA e MAT (Microscopic Agglutination Test). Para determinação de IgG total por ELISA, extratos celulares de L. interrogans sorovares Copenhageni, Canicola e Pomona serão confrontados com os soros dos animais sobreviventes. Adicionalmente, estes soros serão confrontados com antígenos recombinantes imunogênicos de Leptospira (rLigB, rLigA, rLenA, rLipL32 e rLipL41) disponíveis no Laboratório de Vacinologia. Anti-IgG de hamster Golden Syrian conjugado com peroxidase (Rockland) será utilizado como anticorpo secundário. A avaliação do perfil de subclasses induzidas será realizada com anticorpos anti IgG1, anti-IgG3 e anti-IgG2/3 (SouthernBiotech) conforme recomendações do fabricante. Para o MAT, soro dos animais sobreviventes será confrontado com uma bateria de sorovares padrão.
Para os estudos histopatológicos secções de rim, fígado e pulmão serão fixadas com formalina tamponada 10% (pH 7,0), posteriormente embebidas em parafina e seções de 5-6 µm serão coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para identificação de patologia associada à doença.
Para avaliação da indução de imunidade esterilizante tecido renal será macerado e o sobrenadante inoculado em meio EMJH suplementado (Difco, BD, Brasil). As culturas serão mantidas por até 12 semanas em incubação a 30 °C para avaliação de reisolamento de leptospiras em microscopia de campo escuro. Adicionalmente secções de rim, fígado e pulmão serão coletadas e estocadas a –70 ºC para posterior extração de DNA e análise de imunidade esterilizante por PCR quantitativo em tempo real (RT

A leptospirose é uma das zoonoses mais difundidas mundialmente, sendo também negligenciada pelas autoridades de saúde pública. É considerada uma zoonose re-emergente, especialmente em países de clima subtropical e tropical. Atualmente as bacterinas comercialmente disponíveis, em sua maioria compostas por sorovares avirulentos, apresentam imunidade de curta duração com diversas limitações quanto ao espectro de proteção. Com este projeto, buscamos otimizar o processo de produção de bacterinas para leptospirose objetivando a comercialização de um produto com melhor eficácia no mercado. O desenvolvimento deste projeto visa à geração de um produto capaz de induzir imunidade protetora incialmente em animais, e posteriormente em humanos, mais eficiente e de longa proteção contra a leptospirose, impactando positivamente no setor produção animal e na saúde pública.
Este projeto fará parte de um Acordo de Cooperação Técnica firmado com a Ourofino Saúde Animal, uma das maiores industrias nacionais do setor veterinário, que irá fornecer as bacterinas compostas sorovares Canicola, Copenhageni e Pomona virulentos e avirulentos, bem como os respectivos sorovares virulentos para desafio letal. Com os resultados obtidos esperamos realizar o depósito de pedidos de patentes e publicações de trabalhos em periódicos científicos internacionais. Por fim, este estudo também permitirá o treinamento de estudantes de graduação e pós-graduação e a consolidação desta área de pesquisa junto à UFPel.