Nome do Projeto
Avaliação da proteção induzida por bacterinas compostas por sorovares virulentos contra a leptospirose
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/08/2020 - 31/07/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
A leptospirose é uma importante zoonose que causa severos prejuízos na produção agropecuária, bem como doença grave em animais de companhia e em humanos. No setor veterinário, as vacinas disponíveis comercialmente para o controle da doença, conhecidas como bacterinas, possuem sérias limitações como a baixa indução de anticorpos protetores em bovinos e suínos; falha na prevenção da colonização renal e excreção urinária; falha na indução de proteção de longa duração bem como na proteção contra um amplo espectro de sorovares do agente infeccioso. A perda da virulência dos antígenos incluídos nas composições das bacterinas durante o processo de produção industrial é um importante fator que pode afetar a eficácia destas vacinas. Atualmente, são escassas as informações disponíveis a respeito da proteção induzida por bacterinas compostas por sorovares virulentos em sua formulação. Logo, inconsistências relatadas a respeito da eficácia das bacterinas podem estar associadas à perda/redução da sua imunogenicidade, comprometendo o estimulo de uma resposta imune eficaz. Sendo assim, neste trabalho estamos propondo realizar uma análise comparativa da eficácia de bacterinas produzidas com cepas virulentas e avirulentas. Para isso bacterinas de L. interrogans sorovar Copenhageni, Canicola e Pomona, produzidos a partir de culturas virulentas e avirulentas, serão fornecidas pela empresa Ourofino Saúde Animal e avaliadas em modelo experimental de hamsters. Serão realizados esquemas vacinais de uma e duas doses seguido de desafio homólogo e heterólogo. Os resultados obtidos contribuirão para a otimização do processo de produção de bacterinas para leptospirose objetivando a comercialização de um produto com melhor eficácia no mercado.

Objetivo Geral

Avaliar a eficácia de bacterinas produzidas a partir de cepas virulentas e avirulentas dos sorovares Canicola, Pomona e Copenhageni em modelo experimental.

Objetivos específicos:

-Cultivar em meio EMJH os sorovares Canicola, Pomona e Copenhageni virulentos e avirulentos;
-Determinar a ED50 dos sorovares virulentos Canicola, Pomona e Copenhageni;
-Produzir as bacterinas compostas por sorovares virulentos e avirulentos;
-Avaliar a eficácia de cada composição vacinal em hamsters, utilizando esquemas vacinais de uma e duas doses, seguido de desafio homólogo e heterólogo;
-Avaliar a resposta imune induzida pelas composições vacinais descritas acima.

Justificativa

A leptospirose é uma importante zoonose de distribuição global, reemergente e subnotificada, especialmente nos países subdesenvolvidos e de clima tropical (Ko et al., 2009; Pereira et al., 2017). Estima-se que anualmente a doença acometa em torno de 1,03 milhões de pessoas, acarretando em 58,900 mortes (Costa et al., 2015). O gênero subdivide-se, além de espécies saprofíticas e intermediárias, em 17 espécies patogênicas e mais de 300 sorovares, dos quais mais de 260 são classificados como patogênicos e aptos a causar infecção em uma variedade de espécies animais (Adler and Moctezuma, 2010; Vincent et al., 2019).
A infecção é mantida pela persistente colonização dos túbulos renais proximais permitindo com que animais domésticos, especialmente pequenos roedores, além de cães, bovinos, suínos, equinos e animais silvestres ajam como importantes reservatórios de leptospiras em zonas urbanas e rurais (Adler and Moctezuma, 2010; Bharti et al., 2003). Humanos são hospedeiros acidentais e sua infecção ocorre usualmente através do contato direto com a urina de animais portadores de leptospiras patogênicas ou de forma indireta pelo contato com solo e água contaminados (Bharti et al., 2003; Haake and Levett, 2015). Os fatores de risco para a infecção em humanos incluem exposições ocupacionais e recreativas, contato com águas de enchentes e viagens para áreas endêmicas, como países tropicais em desenvolvimento (Haake and Levett, 2015).
Além da preocupação com o impacto na saúde pública, a leptospirose também é responsável por gerar significativas perdas econômicas no setor de pecuária, especialmente em espécies produtoras de alimentos como a carne e o leite, ou ainda de produtos de interesse industrial (Pereira et al., 2017). Nestes animais, a doença esta associada a ocorrência de problemas reprodutivos como retenção de placenta, abortos, nascimento de animais prematuros, natimortos ou fracos e queda da produção leiteira (Adler and Moctezuma, 2010; Pimenta et al., 2018).
A medida de controle mais efetiva para a leptospirose baseia-se na vacinação. As vacinas comercialmente disponíveis consistem em preparações de células inteiras inativadas (bacterinas) (Verma et al., 2013). Estas vacinas são mundialmente aplicadas em cães, bovinos, suínos e equinos, entretanto induzem imunidade somente contra sorovares antigenicamente relacionados àqueles presentes na formulação vacinal e proteção de curta duração, requerendo reforços semestrais (Adler and Moctezuma, 2010; Haake and Levett, 2015). Além disso, estas vacinas podem causar efeitos colaterais locais e generalizados como dor de cabeça, dor muscular, febre e vômito, o que associada às outras limitações descritas acima, limitam sua aplicação em humanos, estando restrita a populações de risco de alguns poucos países altamente endêmicos para a doença (Haake and Levett, 2015; Verma et al., 2013; Xu and Ye, 2018).
No setor veterinário, a eficácia das bacterinas tem sido questionada. Entre os principais problemas relatados estão a baixa indução de anticorpos protetores em bovinos e suínos, bem como imunidade de curta duração e falha na prevenção da colonização renal e excreção urinária (Fávero et al., 2018; Sonada et al., 2018). A qualidade dos antígenos incluídos nas composições das bacterinas é um importante fator que pode afetar a eficácia destas vacinas (Martins et al., 2018). Sabe-se que a virulência de cepas de leptospiras patogênicas diminui após 3-6 passagens in vitro (Johnson and Harris, 1967; Xu and Ye, 2018). Logo, o estabelecimento de um controle de qualidade da imunogenicidade das vacinas requer a manutenção de cepas virulentas para sua produção. No entanto, o processo de produção industrial de vacinas geralmente utiliza cepas padrão com contínuas passagens in vitro. Este processo ocasionalmente acarreta na perda da virulência destas cepas, devido a alterações na integridade e na conformação dos determinantes antigênicos expostos na superfície da bactéria (Martins et al., 2018).
Atualmente, são escassas as informações disponíveis a respeito da proteção induzida por bacterinas compostas por sorovares virulentos em sua formulação. Logo, as inconsistências relatadas a respeito da eficácia das bacterinas (Fávero et al., 2018; Martins et al., 2018; Sonada et al., 2018) podem estar associadas à perda/redução da sua imunogenicidade, comprometendo o estimulo de uma resposta imune eficaz.

Metodologia

Obtenção e cultivo das cepas
Cepas virulentas de L. interrogans sorovares Canicola e Pomona e cepas avirulentas dos sorovares Canicola, Copenhageni e Pomona serão fornecidas pela empresa Ourofino Saúde Animal, através de acordo de cooperação. A cepa virulenta L. interrogans sorovar Copenhageni L1-130, é a cepa padrão utilizada para os estudos em leptospirose e será obtida do banco de cepas do Laboratório de Vacinologia do Centro de Desenvolvimento Tecnológico da Universidade Federal de Pelotas. Todas as cepas serão cultivadas em meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (Difco; BD, Brasil) líquido enriquecido com 10% de suplemento comercial (Difco, BD, Brasil) a 30 °C. As cepas virulentas serão estocadas em nitrogênio líquido (com 2,5% de DMSO) até o momento do uso.
Determinação das doses letais para 50% (DL50) dos animais
infectados com espécies patogênicas de Leptospira sp.
A avaliação das doses letais para 50% (DL50) das cepas Canicola, Copenhageni e Pomona será realizada em hamsters da espécie Mesocricetus auratus linhagem Golden Syrian, fêmeas e machos, com 8-12 semanas de idade. As doses letais serão calculadas pela fórmula de Reed and Muench (1938). Serão utilizados três animais por grupo e estes serão inoculados via intraperitoneal com 1 mL de cada uma das diluições de 108, 106, 104, 102 e 10 leptospiras/mL em PBS-1X no dia 0 do experimento.
Os animais infectados serão monitorados diariamente durante 28 dias. Animais com sinais clínicos de leptospirose e moribundos serão eutanasiados conforme normas e regulamentos do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA. Os critérios utilizados para determinar o momento da eutanásia serão: perda de 10% do peso máximo, prostração, pelo eriçado, apatia, falta de apetite, hematúria, uveíte e hemorragia. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados de acordo com as normas internacionais e em consonância com os princípios éticos de experimentação animal do CONCEA. Todos os procedimentos descritos envolvendo experimentação animal foram submetidos à aprovação pelo Comitê de Ética da UFPel (CEEA 6273-2020).
Preparo das bacterinas
Para o preparo das bacterinas, será realizada a contagem de células viáveis das culturas dos sorovares Canicola, Copenhageni e Pomona virulentos e avirulentos utilizando câmara de Petroff-Hausser (Thomas Scientific®). As culturas com densidade celular de aproximadamente ~1× 108 células/mL serão centrifugadas 12.000 rpm × 10 min e lavadas duas vezes com PBS-1X estéril. A concentração das células será ajustada para obtenção de 108 células/dose de vacina, seguida de inativação física por calor (56 °C por 20 min) ou química por adição de formaldeído. As vacinas serão estocadas a -20 °C até o momento do uso.
Avaliação da eficácia das bacterinas em hamsters
Para análise da eficácia das vacinas serão utilizados hamsters Golden Syrian (Mesocricetus auratus) fêmeas e machos, com 6-8 semanas de idade, procedentes do Biotério Central da UFPel. O experimento será realizado em quatro etapas.
Etapa 1 – Vacinação dos animais com uma dose de cada bacterina compostas pelos sorovares supracitados virulentos X vacinas compostas pelos mesmos sorovares avirulentos frente a desafio homólogo com as respectivas cepas;
Etapa 2 – Vacinação dos animais com duas doses de cada bacterina compostas pelos sorovares supracitados virulentos X vacinas compostas pelos mesmos sorovares avirulentos frente a desafio homólogo com as respectivas cepas;
Etapa 3 – Vacinação dos animais com uma dose de cada bacterina compostas pelos sorovares supra citados virulentos X vacinas compostas pelos mesmos sorovares avirulentos frente a desafio heterólogo;
Etapa 4 – Vacinação dos animais com duas doses de cada bacterina compostas pelos sorovares supra citados virulentos X vacinas compostas pelos mesmos sorovares avirulentos frente a desafio heterólogo.
Para o experimento 1, os animais serão identificados individualmente e então serão divididos aleatoriamente em nove grupos de oito animais cada, totalizando 72 animais conforme descrito na Tabela 2.
Tabela 2 – Vacinação em hamsters com uma dose de bacterinas compostas por sorovares virulentos e avirulentos frente a desafio homólogo.
Grupos Vacina
A Bac Avirulenta Canicola
B Bac Virulenta Canicola
C PBS 1
D Bac Avirulenta Pomona
E Bac Virulenta Pomona
F PBS 2
G Bac Avirulenta L1-130
H Bac Virulenta L1-130
I PBS 3
Para o experimento 2, os animais serão identificados individualmente e então serão divididos aleatoriamente em nove grupos de oito animais cada, totalizando 72 animais conforme descrito na Tabela 3.
Tabela 3 – Vacinação em hamsters com duas doses de bacterinas compostas por sorovares virulentos e avirulentos frente a desafio homólogo.
Grupos Vacina
A Bac Avirulenta Canicola
B Bac Virulenta Canicola
C PBS 1
D Bac Avirulenta Pomona
E Bac Virulenta Pomona
F PBS 2
G Bac Avirulenta L1-130
H Bac Virulenta L1-130
I PBS 3
Para o experimento 3, os animais serão identificados individualmente e então serão divididos aleatoriamente em quinze grupos de oito animais cada, totalizando 120 animais conforme descrito na Tabela 4.
Tabela 4 – Vacinação em hamsters com uma dose de bacterinas compostas por sorovares virulentos e avirulentos frente a desafio heterólogo.

Grupos Vacina Desafio
A Bac Avirulenta Canicola 100XDL50 Pomona
B Bac Virulenta Canicola 100XDL50 Pomona
C PBS 1 100XDL50 Pomona
D Bac Avirulenta Canicola 100XDL50 L1-130
E Bac Virulenta Canicola 100XDL50 L1-130
F PBS 2 100XDL50 L1-130
G Bac Avirulenta Pomona 100XDL50 L1-130
H Bac Virulenta Pomona 100XDL50 L1-130
I Bac Avirulenta Pomona 10XDL50 Canicola
J Bac Virulenta Pomona 100XDL50 Canicola
K PBS 3 100XDL50 Canicola
L Bac Avirulenta L1-130 10XDL50 Canicola
M Bac Virulenta L1-130 10XDL50 Canicola
N Bac Avirulenta L1-130 100XDL50 Pomona
O Bac Virulenta L1-130 100XDL50 Pomona

Para o experimento 4, os animais serão identificados individualmente e então serão divididos aleatoriamente em quinze grupos de oito animais cada, totalizando 120 animais conforme descrito na Tabela 5.
Tabela 5 – Vacinação em hamsters com duas doses de bacterinas compostas por sorovares virulentos e avirulentos frente a desafio heterólogo.

Grupos Vacina Desafio
A Bac avirulenta Canicola 100XDL50 Pomona
B Bac virulenta Canicola 100XDL50 Pomona
C PBS 1 100XDL50 Pomona
D Bac avirulenta Canicola 100XDL50 L1-130
E Bac virulenta Canicola 100XDL50 L1-130
F PBS 2 100XDL50 L1-130
G Bac avirulenta Pomona 100XDL50 L1-130
H Bac virulenta Pomona 100XDL50 L1-130
I Bac avirulenta Pomona 10XDL50 Canicola
J Bac virulenta Pomona 10XDL50 Canicola
K PBS 3 10XDL50 Canicola
L Bac avirulenta L1-130 10XDL50 Canicola
M Bac virulenta L1-130 10XDL50 Canicola
N Bac avirulenta L1-130 100XDL50 Pomona
O Bac virulenta L1-130 100XDL50 Pomona

Em todos os experimentos os animais receberão uma ou duas doses de 0,1 mL de cada formulação vacinal administradas por via intramulscular com um intervalo de 14/21 dias. Amostras de sangue serão coletadas através da punção da veia de maior calibre entre os dentes incisivos inferiores nos dias 0 (pré-vacinação), 14 e 21/28 pós-vacinação. Antes de realizar a coleta de sangue os animais serão submetidos a leve anestesia com isoflurano. O soro será separado por centrifugação e armazenado à -20 °C até a sua utilização.
Após a última coleta de sangue (dia 14 ou 21/28 pós-primeira imunização) os animais serão desafiados com inóculo letal de L. interrogans sorovares Copenhageni cepa L1-130, Canicola capa LO4 ou Pomona e monitorados diariamente durante 28 dias. Animais com sinais clínicos de leptospirose e moribundos serão eutanasiados conforme normas e regulamentos do CONCEA. Os critérios utilizados para determinar o momento da eutanásia serão: perda de 10% do peso máximo, prostração, pelo eriçado, apatia, falta de apetite, hematúria, uveíte e hemorragia. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados de acordo com as normas internacionais e em consonância com os princípios éticos de experimentação animal do CONCEA.
A eficácia da vacina será determinada pelo número de animais sobreviventes ao desafio, quando comparado ao grupo controle. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados e necropsiados, e posteriormente congelados e entregues ao Biotério Central da UFPel, que os encaminha para incineração.
Avaliação da resposta imune induzida em hamsters
A resposta imune humoral será avaliada por ELISA e MAT (Microscopic Agglutination Test). Para determinação de IgG total por ELISA, extratos celulares de L. interrogans sorovares Copenhageni, Canicola e Pomona serão confrontados com os soros dos animais sobreviventes. Adicionalmente, estes soros serão confrontados com antígenos recombinantes imunogênicos de Leptospira (rLigB, rLigA, rLenA, rLipL32 e rLipL41) disponíveis no Laboratório de Vacinologia. Anti-IgG de hamster Golden Syrian conjugado com peroxidase (Rockland) será utilizado como anticorpo secundário. A avaliação do perfil de subclasses induzidas será realizada com anticorpos anti IgG1, anti-IgG3 e anti-IgG2/3 (SouthernBiotech) conforme recomendações do fabricante. Para o MAT, soro dos animais sobreviventes será confrontado com uma bateria de sorovares padrão.
Para os estudos histopatológicos secções de rim, fígado e pulmão serão fixadas com formalina tamponada 10% (pH 7,0), posteriormente embebidas em parafina e seções de 5-6 µm serão coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para identificação de patologia associada à doença.
Para avaliação da indução de imunidade esterilizante tecido renal será macerado e o sobrenadante inoculado em meio EMJH suplementado (Difco, BD, Brasil). As culturas serão mantidas por até 12 semanas em incubação a 30 °C para avaliação de reisolamento de leptospiras em microscopia de campo escuro. Adicionalmente secções de rim, fígado e pulmão serão coletadas e estocadas a –70 ºC para posterior extração de DNA e análise de imunidade esterilizante por PCR quantitativo em tempo real (RT

Indicadores, Metas e Resultados

A leptospirose é uma das zoonoses mais difundidas mundialmente, sendo também negligenciada pelas autoridades de saúde pública. É considerada uma zoonose re-emergente, especialmente em países de clima subtropical e tropical. Atualmente as bacterinas comercialmente disponíveis, em sua maioria compostas por sorovares avirulentos, apresentam imunidade de curta duração com diversas limitações quanto ao espectro de proteção. Com este projeto, buscamos otimizar o processo de produção de bacterinas para leptospirose objetivando a comercialização de um produto com melhor eficácia no mercado. O desenvolvimento deste projeto visa à geração de um produto capaz de induzir imunidade protetora incialmente em animais, e posteriormente em humanos, mais eficiente e de longa proteção contra a leptospirose, impactando positivamente no setor produção animal e na saúde pública.
Este projeto fará parte de um Acordo de Cooperação Técnica firmado com a Ourofino Saúde Animal, uma das maiores industrias nacionais do setor veterinário, que irá fornecer as bacterinas compostas sorovares Canicola, Copenhageni e Pomona virulentos e avirulentos, bem como os respectivos sorovares virulentos para desafio letal. Com os resultados obtidos esperamos realizar o depósito de pedidos de patentes e publicações de trabalhos em periódicos científicos internacionais. Por fim, este estudo também permitirá o treinamento de estudantes de graduação e pós-graduação e a consolidação desta área de pesquisa junto à UFPel.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
MARA ANDRADE COLARES MAIA
NATASHA MORAES RODRIGUES
NATASHA RODRIGUES DE OLIVEIRA
ODIR ANTONIO DELLAGOSTIN1
Pedro Moreira Couto Motta
THAIS LARRÉ OLIVEIRA1

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
Ourofino / Empresa Ourofino Saúde AnimalR$ 150.238,08Fundação Delfim Mendes da Silveira

Plano de Aplicação de Despesas

DescriçãoValor
339039 - Outros Serviços de Terceiro - Pessoa JurídicaR$ 150.238,08

Página gerada em 27/05/2022 23:19:24 (consulta levou 0.087519s)