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Diferente de outras espécies domésticas de interesse zootécnico, os equinos são valorizados como indivíduo, animais de alto padrão genético atingem valores elevados de comércio e reprodução. Éguas e garanhões são selecionados para a reprodução de acordo com seu desempenho esportivo, morfologia, pedigree e não de acordo com sua fertilidade. Fatores fisiológicos e de capacidade reprodutiva muitas vezes são selecionados negativamente, o que leva a menores índices reprodutivos. A compreensão aprofundada dos componentes proteicos e metabólicos do plasma seminal e da célula espermática será importante para desvendar a fisiologia da reprodução. Auxiliando na compreensão da infertilidade na espécie equina, podendo levar ao desenvolvimento de um produto que aumente as características seminais relacionadas à fertilidade masculina.

Os animais que serão utilizados no experimento estarão alojados em criatórios em Porto Alegre, RS, Brasil e cidades próximas. As análises seminais laboratoriais serão realizadas no Laboratório de Reprodução Animal (UFRGS), Laboratório de Virologia (UFRGS) e no Núcleo de Análise de Biomoléculas (UFV).
Serão utilizados garanhões da raça Crioula com histórico reprodutivo conhecido, provenientes de diferentes criatórios, situadospróximos à cidade de Porto Alegre Rio Grande do Sul. Serão coletados quarenta (n=40) garanhões separados em dois Grupos:O Grupo fértil será composto por vinte (n=20) garanhões da raça Crioula com histórico de taxa de concepção ≥ a 50%. O Grupo subfértil será composto por vinte (n=20) garanhões da raça Crioula com histórico de taxa de concepção ≤ a 49%;
Para a coleta do sêmen (Grau de severidade leve), será utilizada vagina artificial modelo Hannover com lubrificação e pré-aquecimento (42°C - 45°C). As coletas são realizadas pelo Veterinário responsável pelo estabelecimento. Durante a execução do projeto o responsável pelos animais conduzirá as coletas e fornecerá o sêmen para análise. Desta forma a equipe de pesquisa não terá contato com os animais evitando possíveis acidentes. Imediatamente após o recebimento do ejaculado, este será filtrado, depositado em um tubo Falcon e encaminhado para o Laboratório de Reprodução Animal da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, acondicionado em caixa térmica em temperatura ambiente, com limite máximo de transporte de duas horas. Um ml de cada ejaculado será reservado para as análises do sêmen fresco e o restante será armazenado para expressão gênica. A concentração espermática será avaliada em câmara de Neubauer (Makler, 1980). As avaliações de Motilidade Total (%) (MT); Motilidade Progressiva (%) (MP); Motilidade Rápida (%) (MR), Motilidade Lentos (%) (ML), Motilidade Local (%) (MC) Velocidade de Trajeto (VAP, μm/s); Velocidade Progressiva (VSL, μm/s); Velocidade Curvilinear (VCL, μm/s); Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH, μm); Frequência de Batimentos (BCF, Hz); Retilinearidade (STR, %) (VSL/VAP); Linearidade (LIN, %) (VSL/VCL) e Velocidade Rápida (VAP,%) serão realizadas através do sistema computorizado CASA (Computer Assisted Sperm Analysis, Tiefenbach, Alemanha, AndroVision®, Minitube).
Para a análise da integridade física da membrana plasmática, 400μl de sêmen serão incubados com 3μl de iodeto de propídio (PI) e 2μl de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA), a 37°C por oito minutos. A amostra será avaliada por microscopia de epifluorescência, em aumento de 1000 x sob imersão. Um total de 100 espermatozoides por amostra será avaliado. Serão considerados íntegros aqueles espermatozoides que apresentaram coloração verde (GARNER et al., 1986).
A integridade funcional da membrana plasmática será avaliada por meio do teste hiposmótico. Para tanto, 200μL de água destilada serão adicionados a 100μL de sêmen. As amostras devem ser incubadas a 37°C por cinco minutos, posteriormente, analisadas em microscópio de contraste de fase em aumento de 400x. Serão avaliados 100 espermatozoides por amostra e considerados íntegros os espermatozoides com enrolamento da cauda (LAGARES et al., 1998). Para avaliação da patologia espermática será utilizado kit panótico® (Laborclin), a lâmina com o esfregaço de sêmen deve ser mergulhada por 10 segundos consecutivamente em cada corante e imediatamente após a secagem, a lâmina será levada ao microscópio de contraste de fase em objetiva de imersão (1000x) para análise serão contadas 100 células espermáticas de cada amostra (CBRA, 2013).
-Armazenamento dos espermatozoides para a extração do mRNA
Uma fração do ejaculado será dividida em tubos Falcon de 15ml e centrifugado a 400 x g durante 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante deve ser descartado e o pellet restante no fundo do tubo Falcon deve ser ressuspenso em meio BPS e centrifugado novamente, esse procedimento será repetido três vezes. O pellet restante após as centrifugações deverá ser ressuspenso em dois ml de RNAlater® (Life Technologies) em criotubo livre de RNA e armazenado em freezer a -80ºC para posterior análise.
Armazenamento dos espermatozoides para a Proteômica
O restante do ejaculado será distribuído em tubos Falcon de 15ml e centrifugado a 400 x g durante 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante deverá ser descartado e o sedimento restante no fundo do tubo Falcon deverá ser ressuspenso em meio BPS e centrifugado novamente, esse procedimento será repetido três vezes. O sedimento restante será depositado em criotubo livre de RNA e armazenado em freezer a -80ºC para posterior análise.
Armazenamento do plasma seminal para a Proteômica e Metabolômica
Através da centrifugação o plasma seminal será separado dos espermatozoides. As amostras serão centrifugadas a 700 x g a 4°C por 10 minutos, após o sobrenadante será transferido para outro criotubo e centrifugado novamente a 10.000 x g a 4°C por 1 hora. Após a segunda centrifugação o sobrenadante será transferido para criotubo livre de RNA e será adicionado 1% (v/v) o inibidor de protease (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma, St. Louis, USA) e armazenado em freezer a -80ºC para posterior análise.
Extração de mRNA total de espermatozoide para caracterizar expressão gênica em transcriptoma
Após o descongelamento as amostras serão centrifugadas a 5000 x g por 5 minutos a 4ºC, a fim de sedimentar os espermatozóides para posterior extração de mRNA. A extração do mRNA será realizada através SV Total RNA Isolation System® (Promega), conforme instruções do fabricante.
Quantificação do mRNA total extraído
A determinação da concentração do mRNA total extraído e pureza será realizada no NanoVue (GE Healthcare Life Sciences), utilizando-se 3μl de cada amostra para a quantificação do mRNA total em ng/μL.
Transcrição reversa
A conversão para cDNA será realizada através de kit comercial GoScript™ Reverse Transcriptase® (Promega), conforme instruções do fabricante.
Preparo da biblioteca de cDNA para o sequenciamento
Para a construção da biblioteca de cDNA utilizaremos TruSeq PE cluster kit v3-cBot-HS (Illumina, PN PE-401-3001) e para a amplificação das amostras, o TruSeq SBS kit v3-HS (Illumina, PN FC-401-3001), ambos conforme a utilização do fabricante. 5.11 qPCR em Tempo Real A qPCR em Tempo Real será realizada no Reprolab/ UFRGS. Após a construção da biblioteca de cDNA serão selecionados vinte (20) genes candidatos para fertilidade em garanhões da raça Crioula. Após a seleção dos genes será quantificada a expressão destes genes em uma população de cento e trinte e seis (n=136) garanhões para confirmar se estes genes alvos podem ser utilizados como biomarcadores de fertilidade na espécie equina. A expressão gênica será analisada com iniciadores projetados no site GenBank. Os primers serão obtidos através da Integrated DNA Technologies (IDT®). Os qPCRs serão realizados com volume final de 25μl, contendo 1μl de ambos os primers e o qPCR Master Mix 2X GoTaq® (Promega Wisconsin, USA). A amplificação será realizada utilizando o termociclador real-time PCR Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific), sendo os dados processados pelo software integrado v2.3. Será realizada uma quantificação relativa e os níveis de mRNA dos genes alvos serão normalizados contra glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ou B-Actina. Um método comparativo thresholdcycle (CT) (2−ΔΔCT) será utilizado para calcular a expressão relativa do mRNA. A sonda fluorescente utilizada será GoTaq® DNA Polymerase conforme instruções do fabricante. O perfil do programa utilizado para a amplificação será 95°C por 10 minutos seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento por 30 segundos e extensão a 60°C por 30 segundos.
Proteômica: Eletroforese
A proteômica será realizada no Reprolab/ UFRGS através de eletroforese.
A Metabolômica: a preparação das amostras para as análises de cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas será realizada de acordo com o método descrito por Velho (2018).
Metabolômica: Análise in silico das redes metabólicas
A bioinformática será utilizada para visualizar redes e vias metabólicas. As redes metabólicas relacionadas aos metabólitos mais abundantes encontrados no plasma seminal e no espermatozoide serão analisadas usando o programa computacional Metscape, versão 3.1.2, o qual é um plug-in do programa Cytoscape, versão 3.2.1. A Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) será usada para a identificação dos compostos (KARNOVSKY et al., 2012).

ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para coleta das amostras o cálculo do tamanho da amostra foi realizado no programa WinPEPI (Programs for Epidemiologists for Windows) versão 11.43. Considerando um nível de significância de 5%, poder de 80% e um tamanho de efeito mínimo de um desvio padrão entre os grupos, obteve-se um total mínimo de 40 cavalos, sendo de 20 por grupo. Para analise estatística será utilizado o programa Statistical Analysis System program (SAS Institute Inc.,Cary, NC, USA) com nível de significância de p<0,05. A correlação simples de Pearson será utilizada para verificar relações entre as características estudadas

Espera-se determinar biomarcadores moleculares para o diagnóstico de infertilidade em garanhões da raça Crioula;
 Produzir uma tese para conclusão do Doutorado em Medicina Animal: Equinos –UFRGS;
 Publicar artigos em revista de circulação nacional e internacional, no “Sistema de Classificação de Periódicos, Anais e Revistas” da CAPES;
 Divulgar os resultados em congressos em âmbito nacional e internacionais.