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A infecção pelo novo Coronavírus (SARS-CoV-2), descoberto no final de 2019, denominada (Covid-19), acomete mais de 1,5 milhões de indivíduos e registra mais de 92 mil óbitos em todo o mundo (WHO, 2020). No Brasil, a estimativa de ocorrência da doença, que era de no mínimo 14 mil casos confirmados e cerca de 800 mortes, já foi ultrapassada mesmo havendo uma subnotificação de casos devido à indisponibilidade de diagnóstico para a maioria da população. No momento as ações, segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO), concentram-se principalmente na prevenção de infecções, detecção, monitoramento e cuidados de suporte, visto que nenhum tratamento anti-SARS-CoV-2 específico é recomendado devido à ausência de evidências (CHEN et al., 2020).
Estudos sugerem que a administração de plasma ou soro convalescente, bem como de imunoglobulina específica, produzirá um efeito preventivo e também clínico no tratamento de Covid-19 pois, diferente da imunização ativa, a transferência passiva de anticorpos não requer o desenvolvimento de resposta imune, conferindo imunidade de forma imediata (CASADEVALL & PIROFSKI, 2020). A eficácia da terapia baseada na administração de plasma ou soro convalescente se dá pela capacidade dos anticorpos disponibilizados de neutralizar o vírus e suprimir a viremia, acelerando a recuperação dos tecidos infectados e prevenindo possíveis reinfecções (LU et al., 2016). Pesquisas relacionadas a infecções respiratórias graves por coronavírus (SARS) e influenza revelaram evidências consistentes de redução da mortalidade e do período de internação, especialmente quando o plasma convalescente foi administrado logo após o início dos sintomas, período em que a carga viral é menor em relação à doença já estabelecida (SOO et al., 2004; CHENG et al., 2005, LAI, 2005; MAIR-JENKINS et., 2015).
No entanto, problemas de segurança com relação à administração de plasma, como a transmissão de doenças, reações alérgicas e eficácia variável, tornam seu uso uma abordagem controversa (ERHABOR et al., 2011). Ainda, limitações a cerca da disponibilidade, acompanhamento e análise do histórico clínico de pacientes, coleta suficiente de plasma ou soro anti-SARS-CoV-2 para atender a demanda atual e criação de um banco de plasma devem ser considerados.
O uso de anticorpos policlonais, obtidos a partir de soro hiperimune produzido através da imunização de animais, pode superar as limitações do uso de soro convalescente, visto que os anticorpos podem ser caracterizados e produzidos em larga escala. Devido à facilidade de gerenciamento e alto rendimento de anticorpos, o modelo equino é o mais usado na produção de soros (ZHENG et al., 2016). Os efeitos colaterais desta terapia, como reações anafilactóides, são evitadas ou reduzidas com a purificação dos anticorpos e remoção da porção Fc das imunoglobulinas, tornando a terapia aplicável a humanos (BLEEKER et al., 2000; GUIDOLIN et al., 2016; RATANABANANGKOON et al., 2016; WANG et al., 2018). No cenário de infecções virais, anticorpos produzidos em equinos são usados na terapia de infecções víricas como: Ebola (JAHRLING et al., 1996), Raiva (LANG et al., 1998; SATPATHY et al., 2005), Hepatite B (CHIBA et al., 20003; DAHMEN et al., 2004) e HIV (WATT et al., 2001; FERRANTELLI et al, 2002).
A proteína S (spike protein) presente no envelope viral do SARS-CoV-2, bem como de outros coronavírus, é responsável por mediar o processo de entrada na célula hospedeira. Ela é clivada pelas proteases do hospedeiro nas subunidades S1 e S2, as quais são responsáveis pelo reconhecimento do receptor e fusão na membrana celular, respectivamente (WANG et al., 2020). Trata-se de um dos principais determinantes da virulência do vírus, do tropismo tecidual e da variedade de hospedeiros. Vírus RNA, como o SARS-CoV-2, apresentam frequentes mutações, contudo, são poucas as diferenças encontradas na proteína S das variantes emergentes de SARS-CoV-2. Até o início de março de 2020, as sequencias de resíduos de aminoácidos da proteína S de isolados no Brasil, Estados Unidos, Índia e China permaneceram idênticas, o que a torna o principal alvo da neutralização de anticorpos e desenvolvimento de vacinas atualmente (ROBSON, 2020). Pesquisadores desenvolveram anticorpos monoclonais que se ligam a proteína S, impedindo a infecção de novas células in vitro (TIAN et al., 2020). Acredita-se que uma terapia baseada em um coquetel de anticorpos pode atuar na prevenção e tratamento de COVID-19.
Neste contexto, nosso estudo propõe estabelecer uma terapia baseada na administração de anticorpos (F(ab’)2) anti-SARS-CoV-2 e contra epítopos da proteína S produzidos a partir da imunização de equinos, visando disponibilizar uma terapia capaz de atuar na profilaxia da doença, bem como no tratamento de indivíduos acometidos pelo SARS-CoV-2.

Aspectos éticos. Os experimentos realizados em equinos serão realizados de acordo com as recomendações do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA e do Comitê de Ética em Experimentação Animal – CEEA/UFPel. Os ensaios clínicos serão realizados de acordo com as recomendações da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP).

Antígenos. O vírus SARS-CoV-2 será fornecido pelo Dr. Fernando Spilki (Feevale). Os antígenos recombinantes (epítopos da proteína S) serão selecionados e desenhados através de vacinologia reversa, o plasmídeo contendo o gene de interesse será clonado em diferentes vetores, visando determinar o melhor sistema de expressão para a manutenção das características da proteína nativa, como os sítios de glicosilação e a conformação estrutural, a fim de manter o potencial antigênico da proteína. A equipe do laboratório de Microbiologia (Biotecnologia-UFPel), coordenado pelo Dr. Fábio Leite, realizará a clonagem no vetor de expressão Pichia pastoris (DUMMER et al., 2009; AHMAD et al., 2014; BAGHBAN et al., 2018), enquanto que a expressão em E. coli (RAMOS et al., 2004; JIA & JEON, 2016; GILEADI, 2017) será realizada nos laboratórios de Imunologia Aplicada e Pesquisa em Doenças Infecciosas sob coordenação do Dr. Fabrício Conceição e Dr. Alan McBride (UFPel). Ainda, no laboratório de Virologia e Imunologia da Faculdade da Veterinária/UFPel, coordenado pelos Dr. Geferson Fischer e Dr. Marcelo Lima será realizada a expressão em Baculovírus (CHAMBERS et al., 2018, IRONS et al., 2018; KOST & KEMP, 2016).
Produção do soro hiperimune. A produção do soro hiperimune será realizada pela imunização de equinos saudáveis disponibilizados pelo Centro de Ensino e Experimentação em Equinocultura da Palma (CEEEP) e em colaboração com Hospital de Clínicas Veterinárias, ambos da UFPel. Os equinos serão selecionados por peso e volume sanguíneo, hematócrito e proteína plasmática total. Para a produção de soro anti-SARS-CoV-2 os animais serão imunizados via subcutânea com doses de 2 mL contendo 108 UFP do vírus SARS-CoV-2 inativado e adicionado a uma emulsão oleosa múltipla como adjuvante. Além do soro contra a partícula viral total também será produzido soro contra epítopos recombinantes da proteína S. A produção será feita através da imunização dos animais com 0,8 mg da proteína recombinante adsorvida em emulsão oleosa. As imunizações serão realizadas nas semanas 0, 2, 4 e 6 e amostras de sangue serão coletadas, por punção da veia jugular, nas semanas 1, 3, 5 e 7 para a obtenção do soro e monitoramento da soroconversão através de ELISA indireto. Poderão ser realizadas doses extras de imunização de acordo com a produção de anticorpos. Inicialmente, cada antígeno será administrado em 5 equinos, visando o rendimento de 6 a 12 mg de anticorpo/L de sangue. Ao final do processo de imunização será coletado sangue (~2% do peso vivo) em bolsas estéreis (sistema fechado) aproximadamente 5 litros de plasma por sangria em ciclo de 1 hora total. Os equinos serão avaliados por exame clínico e por meio de hematologia diariamente para avalição da resposta inflamatória ou infecciosa.

Purificação das IgG e obtenção da porção F(ab)2. O sangue dos animais imunizados será centrifugado para a obtenção do soro hiperimune. Para a purificação de IgG total, o soro será diluído em solução salina fosfatada (PBS) na proporção de 1:8, e centrifugado à 16.000 g rpm por 30 min. O sobrenadante será submetido a filtração através de filtro de 0,45 µm, e então purificado por cromatografia de afinidade em colunas conjugadas à proteína A. A obtenção do porção F(ab’)2 será realizada utilizando a enzima pepsina para remover a porção Fc das imunoglobulinas. Para isso, as IgG totais serão diluídas com tampão acetato de sódio (0,2 M, pH 3,0) para 1,0 mg / ml, e a pepsina será então adicionada em uma proporção de massa de 1:50. A reação de digestão será realizada a 37 °C por 36 h e então finalizada pela adição de tampão Tris-base (2 M, pH 9,0) para ajustar o pH para 7,0. Os produtos de digestão serão purificados em coluna de proteína A e o fluido eluído será submetido à filtração tangencial para remover a pepsina e pequenas proteínas moleculares. As frações F(ab)2 serão quantificadas pelo método BCA e submetidas a SDS-PAGE para verificar vestígios não digeridos.

Caracterização do soro hiperimune. Os anticorpos (F(ab)2) serão caracterizados e titulados através de ELISA indireto utilizando como antígeno o vírus SARS-CoV-2 inativado (106–108/cavidade) e os epítopos virais recombinantes (50–200 ng/cavidade). Os antígenos serão diluídos em tampão carbonato-bicarbonato (pH 9.0) e adicionados às microplacas. Os anticorpos serão diluídos (1:100–1:12000) em solução salina fosfatada (PBS) e adicionados em triplicada às cavidades. Será utilizado o anticorpo anti-equino conjugado com peroxidase e posteriormente, o substrato contendo OPD (O-fenilodiamina) e peróxidos de hidrogênio. A caracterização também será realizada através de Western blot a fim de determinar o epítopo viral imunodominante reconhecido pelos anticorpos. Para a execução da técnica, os antígenos serão submetidos a SDS-PAGE e em seguida, eletrotransferidos para membrana de nitrocelulose. Os anticorpos serão adicionados à membrana após o bloqueio da mesma a fim de evitar reações inespecíficas. Será novamente utilizado o anticorpo anti-equino conjugado com peroxidase e posteriormente, o substrato à base de DAB (3'3 Diaminobenzidine).

Soroneutralização. O título de anticorpos (F(ab’)2) neutralizantes será determinado através do teste de neutralização do efeito micro-citopático (CPE) com SARS-CoV-2. Os fragmentos F(ab')2 anti-SARS-CoV-2 e epítopos recombinante (S) serão diluídos de 1:10 a 1:5120. As soluções de anticorpos (100 μl) serão misturadas em 1:1 (v/v) com suspensão contendo 108 UFP do vírus SARS-CoV-2 e incubadas a 37 ° C por 1 h. A mistura vírus-anticorpo será transferida para placas de 96 cavidades contendo monocamadas de células (ex. Vero, MRC-5 ou MDCK) e incubadas a 37 °C em estufa contendo 5% de CO2. Serão adicionados controles contendo somente o vírus e somente os anticorpos. O efeito micro-citopático será observado a cada 24 h durante por 6 dias. O título de anticorpos neutralizantes será expresso como o valor recíproco da maior diluição de F(ab')2 capaz de neutralizar o vírus.

Avaliação da inocuidade: Para verificar a inocuidade dos anticorpos, caracterizando quaisquer efeitos colaterais, estes serão administrados via intravenosa (15-10 mg/kg) em 20 voluntários saudáveis. Os indivíduos serão monitorados, pelo período de duas semanas, quanto aos sinais fisiológicos como: temperatura corporal, frequência cardíaca e respiratória, náusea, vertigem, cefaleia ou qualquer outro sinal distinto da condição saudável habitual do indivíduo. Serão realizadas coletas de sangue, antes e após a administração dos anticorpos, para análises bioquímicas e caracterização da resposta imune.

Eficácia do tratamento. A efetividade do tratamento será verificada por colaboradores do Hospital Escola (UFPel). Brevemente, os anticorpos serão administrados via intravenosa em 20 pacientes internados diagnosticados com Covid-19. Os protocolos de administração e avaliação do tratamento serão estabelecidos pela equipe médica responsável e submetidos à aprovação dos comitês de ética

Ao final do primeiro trimestre pretende-se obter o soro hiperimune anti-SARS-CoV-2 e contra os epítopos recombinantes.
A partir do soro hiperimune serão obtidos os anticorpos - porção F(ab’)2. Estima-se a obtenção de aproximadamente 24 g de anticorpos F(ab’)2 anti-SARS-CoV-2 e contra os epítopos recombinantes por animal imunizado, no segundo trimestre.
Posteriormente, os anticorpos serão caracterizados através de ELISA indireto, Western blot e soroneutralização. E, em seguida, será realizada a avaliação da inocuidade dos anticorpos em indivíduos saudáveis.
Devido a urgência de uma terapia que possa ser implementada no tratamento de Covid-19, serão realizados esforços para que os anticorpos sejam disponibilizados o mais breve possível. Neste sentido, os protocolos serão padronizados, ainda durante o período de imunização dos equinos, utilizando soros já disponíveis no laboratório. Imediatamente após as análises de soroneutralização e inocuidade, os anticorpos serão fornecidos ao Hospital Escola da UFPel para avaliação da eficácia no tratamento de Covid-19.

Com o desenvolvimento do projeto serão obtidos anticorpos anti-SARS-CoV-2 que poderão ser utilizados na prevenção, tratamento e diagnóstico de Covid-19.
O uso dos anticorpos no tratamento de pacientes infectados por Covid-19 neutralizará o vírus, impedindo ou reduzindo a sua replicação e com isso impedirá a evolução dos sintomas, promovendo a remissão da doença e o restabelecimento da saúde do paciente em um menor período. A estratégia de tratamento com imunização passiva permitirá uma resposta rápida, essencial em casos graves.
O estabelecimento de um protocolo eficaz para o tratamento de Covid-19, baseado em anticorpos anti-SARS-CoV-2, diminuirá o período de interação do paciente, reduzindo os custos e a demanda por atendimento hospitalar.
Os anticorpos também poderão ser utilizados na profilaxia de Covid-19, especialmente para profissionais da saúde que estão propensos ao contato com o vírus. Além disso, anticorpos anti-SARS-CoV-2 poderão ser aplicados no desenvolvimento de testes de diagnóstico rápido da doença, contribuindo para o tratamento precoce e monitoramento da evolução dos casos em estudos epidemiológicos.
A detenção da tecnologia de produção pelo Brasil proporcionará a sua independência neste setor e diminuirá despesas relacionadas à importação.