Nome do Projeto
Produção de insumos para análise da resposta imune celular em hamsters
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/08/2020 - 31/07/2022
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Multidisciplinar
Resumo
O hamster sírio (Mesocricetus auratus) é suscetível a uma variedade de patógenos, sendo um excelente modelo para várias doenças humanas. No entanto, a falta de reagentes disponíveis para essa espécie limitam análises de resposta imunológica, especialmente no que se refere à determinação da concentração sérica de moléculas efetoras, como citocinas. Apesar da identidade de sequência de algumas citocinas ser alta (> 90%) entre diferentes espécies de roedores, kits de ELISA disponíveis para quantificação sérica dessas proteínas em ratos e camundongos já demonstraram não ter eficácia confiável para serem utilizados com amostras de hamster. Assim sendo, nesse projeto pretende-se clonar e expressar citocinas de hamster na forma recombinante e produzir anticorpos contra as mesmas, a fim de se obter insumos que possam ser usados na análise de imunidade celular nesse modelo animal.

Objetivo Geral

Objetivo geral:

Produzir e caracterizar citocinas de hamster sírio na forma recombinante, bem como anticorpos contra as mesmas, almejando sua utilização como insumos para análise de imunidade celular neste modelo animal.


Objetivos Específicos:

-Desenhar oligonucleotídeos para amplificação das sequências de cDNA das citocinas
-Amplificar e clonar as sequências de cDNA das citocinas no plasmídeo pAE
-Expressar e purificar as citocinas na forma recombinante usando Escherichia coli como célula hospedeira
-Produzir anticorpos policlonais contra as citocinas em ratos
-Avaliar as citocinas e anticorpos produzidos em ensaios de Western blot e ELISA

Justificativa

O hamster sírio (Mesocricetus auratus) é suscetível a uma variedade de patógenos, sendo um excelente modelo para várias doenças infecciosas humanas, como leishmaniose, e leptospirose, e também para doenças não transmissíveis, como o câncer (Valentine et al., 2012; Ying et al., 2015; Joshi et al., 2016). Este modelo tem sido utilizado para o estudo de doenças associadas a humanos há mais de 60 anos, apresentando uma resposta imunológica, frente a infecções causadas por patógenos, muito semelhante à resposta humana (Miao et al., 2019). O desenvolvimento de terapias e medidas profiláticas para estas doenças deve ser intimamente associado à análise dos mecanismos de ação e fatores imunológicos determinantes de eficácia (Valentine et al., 2012).

Enquanto diversos insumos estão disponíveis para avaliação da imunidade em outros modelos animais, como camundongos e ratos, as análises imunológicas em hamsters restringem-se a insumos para análise da resposta humoral e isotipagem de anticorpos (Felix et al., 2020; Zivcec et al., 2011; Miao et al., 2019; Warner et al., 2017). A análise da resposta celular nesse modelo animal fica condicionada, majoritariamente, à avaliação dos níveis de mRNA de citocinas pró- e anti-inflamatórias (Zivcec et al., 2011). No entanto, sabe-se que análises transcricionais podem não refletir o proteoma, devido à mecanismos de regulação da expressão gênica envolvendo alterações pós-transcricionais e pós-traducionais (Vogel & Marcotte, 2012; Overbergh et al., 2003). Além disto, alguns estudos têm demonstrado que algumas citocinas humanas como o fator estimulador das colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) (Cho et al., 2006) e interleucina-12 (IL-12) (Wang et al., 2017), são totalmente funcionais em modelos de hamster, mas não em modelos murinos (Miao et al., 2019).

A avaliação da produção das citocinas a nível proteômico normalmente baseia-se na utilização de testes de ELISA (Warner et al., 2017). Considerando que alguns genes são conservados e que as proteínas por eles codificadas chegam a apresentar mais de 90% de identidade entre diferentes espécies de roedores (Melby et al., 1998; Espitia et al., 2010), foi levantada a hipótese de que alguns ensaios para quantificação de citocinas já disponíveis para ratos e camundongos poderiam apresentar reação cruzada com amostras de hamster (Safronetz et al., 2011). No entanto, um estudo demonstrou, após avaliação de 63 diferentes testes, que a reatividade cruzada com proteínas de hamsters é limitada, e que, portanto, esses testes não são confiáveis para monitorar proteínas envolvidas na resposta imune de hamsters (Zivcec et al., 2011).

Assim sendo, nesse projeto pretende-se clonar e expressar citocinas de hamster na forma recombinante e produzir anticorpos contra as mesmas, a fim de se obter insumos que possam ser futuramente usados no desenvolvimento de um ensaio para análise de imunidade celular nesse modelo animal.

Metodologia

Cepas e condições de cultivo
As cepas de Escherichia coli DH5α e BL21 DE3 Star serão cultivadas em caldo ou ágar Luria-Bertani (LB) à 37 °C, com suplementação do antibiótico ampicilina (100 mg/mL) quando necessário.

Clonagem das sequências codificadoras das citocinas
As sequências dos transcritos das citocinas IL-10, IL-12p40, IFN-ɣ, IL-4, TNF-α, IL-2, IL-6 e TGF-β serão obtidas através do banco de dados NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e analisadas através do software Vector NTI para o desenho dos primers. Sequências correspondentes ao peptídeo sinal serão identificadas através do software online SignalP-5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) e removidas. Sequências nucleotídicas correspondentes aos sítios de restrição de enzimas (BamHI, EcoRI, KpnI e BglII) serão adicionadas às extremidades dos primers para posterior clonagem em vetor plasmidial pAE. Para obtenção de DNA molde a ser usado na PCR, será extraído o RNA total a partir de tecido de hamster usando o reagente Trizol®, conforme instruções do fabricante, e o cDNA será sintetizado utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). Os genes alvo serão amplificados através da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando o cDNA sintetizado como molde e os primers correspondentes. Os genes serão clonados em vetor pAE através da digestão com enzimas de restrição e ligação com a enzima T4 DNA ligase. Os plasmídeos recombinantes serão utilizados para transformar E. coli DH5α por eletroporação. Os cultivos transformados serão plaqueados em ágar LB contendo 100 µg/mL de ampicilina, e a triagem dos clones recombinantes será realizada por extração rápida de DNA com fenol-clorofórmio, seguido de confirmação por PCR e digestão com as enzimas de restrição acima citadas.

Expressão e purificação das citocinas recombinantes
Os plasmídeos recombinantes construídos serão usados para transformação de Escherichia coli BL21 (DE3) STAR e a expressão das proteínas será induzida com 1 mM de IPTG. A purificação das proteínas será realizada por cromatografia de afinidade ao níquel em coluna de sepharose (HisTrap). A pureza e concentração das proteínas serão determinadas através de SDS-PAGE e quantificação pelo Kit BCA (Pierce).

Produção de anticorpos policlonais
As proteínas purificadas serão utilizadas para produção de soro em ratos Wistar com 6 semanas de idade. Os animais serão imunizados em esquema de três doses com intervalo de 21 dias para a 2ª dose e 14 dias para a 3ª dose, cada uma contendo 50 µg de cada proteína recombinante emulsificada em adjuvante de Freund (completo na primeira dose e incompleto nas doses subsequentes). A eutanásia dos animais será feita por aprofundamento de anestesia inalatória e exsanguinação cardíaca para coleta de sangue. O soro será coletado semanalmente e armazenado a – 20 °C para as posteriores análises de ELISA e Western Blot. Posteriormente, será realizada a titulação individual dos soros reagentes por ELISA indireto. Todos os procedimentos descritos acima foram submetidos à aprovação pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFPel.

Avaliação da reatividade dos insumos
Amostras do sobrenadante do cultivo de esplenócitos de hamsters, contendo as citocinas secretadas, serão utilizadas para caracterização dos insumos produzidos. A confirmação da expressão das citocinas alvo nessas amostras será realizada através de PCR quantitativo em tempo real, utilizando-se mRNA previamente extraído dos esplenócitos. O sobrenadante do cultivo de esplenócitos, expressando as citocinas alvo, e diluições seriadas das citocinas recombinantes serão avaliados por Westen blot frente aos anticorpos anti-citocinas produzidos. Anti-rato conjugado com peroxidase será utilizado como anticorpo secundário.
Adicionalmente, pretende-se caracterizar os insumos produzidos através de ELISA sanduíche. Para isto, além dos anticorpos policlonais anti-citocinas produzidos em ratos, que serão usados como anticorpo de captura no ELISA, será necessário um segundo anticorpo contra cada citocina, a ser usado como anticorpo de detecção. Esse segundo anticorpo, de detecção, deve ligar-se à um epítopo diferente daquele reconhecido pelo anticorpo de captura, para evitar a competição pela ligação à citocina alvo. Assim, espera-se produzir anticorpos monoclonais para detecção de cada citocina através da técnica de phage display, a ser realizada por um grupo parceiro. Os anticorpos monoclonais serão caracterizados por Western blot quanto ao reconhecimento de cada citocina e posteriormente avaliados no ELISA sanduíche, em combinação com os policlonais previamente produzidos. Para isto, placas de poliestireno de 96 cavidades serão sensibilizadas com os anticorpos policlonais anti-citocinas produzidos (captura) e posteriormente incubadas com o sobrenadante do cultivo de esplenócitos e uma curva padrão das respectivas citocinas recombinantes. Anticorpos monoclonais anti-citocinas, produzidos por phage display e conjugados com peroxidase, serão utilizados como anticorpos secundários (detecção). Diferentes combinações de pares de anticorpos e diferentes concentrações de insumos serão avaliados a fim de estabelecer a melhor condição para o ELISA e determinar limites de detecção.

Análise estatística
Análise de variância (ANOVA) será utilizada para determinar diferenças significativas nos ensaios de ELISA. Diferenças serão consideradas significantes com um valor de P < 0,05. Todas as análises serão conduzidas no software GraphPad Prism 7 (GraphPad Software).

Indicadores, Metas e Resultados

• Produção e caracterização das citocinas recombinantes
• Produção e caracterização dos anticorpos anti-citocinas
• Validação dos insumos produzidos frente a amostras biológicas de hamsters

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
AMILTON CLAIR PINTO SEIXAS NETO
ANA CAROLINA KURZ PEDRA
ANDRIELE BONEMANN MADRUGA
FRANCISCO DENIS SOUZA SANTOS
ILANA FIGUEIRA DA SILVA
MARA ANDRADE COLARES MAIA
NATASHA RODRIGUES DE OLIVEIRA
ODIR ANTONIO DELLAGOSTIN1
THAIS LARRÉ OLIVEIRA1
TIFFANY THUROW BUNDE

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