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A agricultura tem enfrentado diversos fatores que afetam a produtividade de plantas cultivadas, dentre eles, os mais importantes danos são
causados por insetos, doenças e competição com plantas daninhas (Cagliari et al., 2019). Plantas daninhas compreendem o maior fator biótico que
limita a produtividade de espécies cultivadas bem como a segurança alimentar. Algumas plantas daninhas são consideradas mais problemáticas e
nocivas devido a sua ocorrência generalizada, a grande interferência na produtividade e o difícil manejo (Bajwa et al., 2016).
Nesse sentido, a resistência aos herbicidas em plantas daninhas é um dos principais problemas enfrentados pelo setor agrícola. Desde a introdução
do glifosato como um herbicida comercial em 1974, mais de 45 espécies de plantas daninhas já desenvolveram mecanismos de resistência a este
agente (revisado por Duke, 2019). A introdução da soja transgênica resistente ao glifosato promoveu um aumentado significativo no uso deste
herbicida, o que pode atuar na seleção de espécies resistentes ao herbicida (Pittelkow et al., 2009).
Levando em consideração estes importantes fatores que afetam a produção vegetal, os progressos significativos nas técnicas genética reversa tem
contribuído com a agricultura moderna nos últimos anos. A elucidação do mecanismo de silenciamento gênico em organismos eucariontes,
chamado de RNA de interferência (RNAi), realizada por Fire e colaboradores em 1998, é considerado um dos maiores progressos. O RNAi é um
sistema de silenciamento gênico pós-transcricional é e um mecanismo natural da regulação da expressão gênica e do sistema de defesa contra
vírus em células eucarióticas (Fire et al., 1998). Através deste sistema, ocorre a degradação do RNA mensageiro (mRNA) e redução ou eliminação
completa da expressão do gene alvo.
O silenciamento gênico pode ser desencadeado no organismo alvo pelo suprimento de RNAs em duas formas, a entrega de moléculas de RNA
dupla fita (dsRNA) ou entrega direta de pequenos RNAs (sRNAs) (Cagliari et al., 2019). Em plantas, o mecanismo de RNAi é desencadeado por um
RNA fita dupla (dsRNA – double stranded RNA) (Dalakouras et al., 2019). Uma vez na célula vegetal, os dsRNAs são processados por uma
endonuclease, DICER-LIKE (DCL) em pequenos fragmentos de 21-24 nucleotídeos (nt), chamados de pequeno RNA de interferência (siRNA –
short interfering RNAs). Os siRNAs vegetais possuem 2 nt coesivos na região 3’, o que os mantém estabilizados através da metilação pela proteína
HUE ENANCER1 (HEN1). Após esta modificação e dependendo do nucleotídeo na região 5’ terminal, uma das fitas do RNA (sRNA) é alocada na
proteína ARGONAUTA (AGO) (revisado por Dalakouras et al., 2019). A proteína AGO mais o sRNA compõem o Complexo de Silenciamento Induzido por RNA (RISC -
RNA-induced silencing complex). O sRNA funciona como um guia para direcionar o RISC para o RNA alvo através do pareamento complementar
de bases (revisado por Fang e Qi, 2016). A função da AGO é de clivagem endonucleolítica de seu alvo de RNA em uma única ligação fosfodiéster.
A estrutura da AGO garante que a clivagem esteja sempre entre os nt alvo emparelhados com o décimo e décimo primeiro nt do RNA guia (Cenik e
Zmore, 2011). De forma interessante, a natureza do mecanismo de RNAi é conservado entre os eucariotos (Lindbo, 2012), podendo assim ser
aplicado em uma ampla gama de espécies vegetais.
Levando em consideração o potencial do mecanismo de RNAi no silenciamento gênico em plantas, a utilização de RNAi combinada com as
técnicas de engenharia genética tem sido utilizada desde o final da década de 80. Os primeiros ensaios com plantas transgênicas as quais foi
inserido RNAi exibiram supressão e silenciamento gênico (Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990) demonstrando o potencial dessa ferramenta
na biotecnologia vegetal. A indução do mecanismo RNAi ocorre pela inserção de um dsRNA via transformação genética utilizando o sistema viral
VIGS (virus-induced gene silencing) e o sistema bacteriano plasmidial com inserção via Agrobacterium tumefaciens (Dalakouras et al., 2019).
Pesquisadores tem utilizado o RNAi para estudos da função gênica, para a indução de resistência a vírus, insetos e nematoides bem como na
engenharia de metabolitos (Lindbo, 2012). Um dos mais importantes marcos na agricultura foi a utilização do mecanismo RNAi no desenvolvimento
do tomate transgênico FLAVR SAVRTM, desenvolvido pela Monsanto em 1994. O FLAVR SAVRTM possui um dsRNA guia para o gene codificante
para a poligalacturonase, levando o silenciamento do gene e promovendo atraso no amolecimento da poupa (ISAAA, 2020). Apesar da sua
potencialidade como ferramenta para melhorar características de interesse agronômico, a utilização de RNAi via transgenia tem enfrentado críticas
severas que afetam a sua aprovação (Dalakouras et al., 2019). Além disso, é estimado um custo de 140 milhões de dólares para comercializar uma
planta transgênica (Rosa et al., 2018).
Nesse sentido, tem surgido nos últimos anos, estratégias de indução do mecanismo RNAi envolvendo aplicação exógena de moléculas de RNA
(GMO-free). O primeiro registro da aplicação exógena de RNA desencadeando o mecanismo RNAi em plantas, foi descrito em 2011, através da
patente da Monsanto envolvendo a aplicação de dsRNA através de aspersão em Nicotiana benthamiana, produzindo um sRNA dirigido para a o
gene codificante para fitoeno desnaturase (Sammons et al., 2011, patente nº: US20110296556A1). Além de aspersão, outros métodos de entrega
de RNA foram testados, como infiltração foliar (Numata et al., 2014) e através de irrigação, após a observação de que as raízes podem absorver
RNA (Jiang et al., 2014; Li et al., 2015). No entanto, a estrutura das células vegetais, que apresentam parede celular compostas majoritariamente
de celulose e que podem variar em espessura, compreendem uma barreira física na entrega do RNA. Para facilitar a entrega do RNA dentro das
células vegetais, as moléculas de RNA são usualmente conjugadas com compostos carreadores (Jiang et al., 2014; Numata et al., 2014). Dentre os
compostos já descritos, estão o peptídeo transportador carregado positivamente, nanopartícula fluorescente catiônica e nanoestruturas de DNA
(Jiang et al., 2014; Numata et al., 2014, Li et al., 2015, Zhang et al., 2019). Controversamente, apesar de os conjugantes facilitarem a entrega do
RNA, existe um custo elevado para sua produção e dificuldades para sintetizá-los (Dalakouras et al., 2019). Frente a isso, pesquisadores tem
desenvolvido estratégias de baixo custo e alta eficiência para a entrega do RNA, como aspersão em alta pressão e aplicação através de escovação
da superfície foliar (Dalakouras et al., 2016; Dubrovina et al., 2019). A Startup NanoSur, dos Estados Unidos da América (EUA), desenvolveu um
método de modificação química pós-transcricional do RNA, dsRNA modificado (MdsRNA - modified double strand RNA), o qual está protegido sob
patente nos EUA (Patente nº 10,131,911 - https://patents.justia.com/patent/10131911). Em geral, a modificação química compreende uma
modificação na região 2’OH da ribose. A modificação química pós-transcricional melhora a estabilidade do dsRNA no ambiente e durante a ingestão
por organismos hospedeiros, no entanto são suscetíveis a degradação eventual no ambiente, reduzindo o impacto ambiental. Além disso, o
MdsRNA pode ser produzido em larga escala. O MdsRNA pode ser utilizado para silenciar a expressão de genes que causam a morte, inibição do
crescimento ou redução da reprodução em animais, fungos ou plantas daninhas.
A utilização de RNAi em sistemas não transformáveis tem sido utilizado para a proteção de espécies cultivadas contra insetos, nematoides e
patógenos (revisado por Zhang et al., 2013; Kim et al., 2015; Lombardo et al., 2016; McLoughlin et al., 2018; Zotti et al., 2018; Liu et al., 2019;
Werner et al., 2019). Apesar da eficiência comprovada da utilização de RNAi no controle de pragas e doenças, não há registros na literatura do uso
de RNAi em sistemas não transformáveis para o controle de plantas daninhas. Dessa forma, este projeto tem como objetivo o estudo da utilização
desse sistema no controle de crescimento de plantas daninhas, utilizando o arroz como planta modelo para os testes iniciais de tamanho do dsRNA,
eficiência de entrega e eficiência de entrega do MdsRNA e do dsRNA encapsulado em nanopartícula. Através deste projeto é esperado o
desenvolvimento de um método de entrega de dsRNA para desencadeamento do mecanismo RNAi em plantas daninhas, utilizando um MdsRNA.

Atividade 1 – Desenvolvimento de dsRNAs para o controle de plantas daninhas
Os genes alvo para o sistema RNAi serão escolhidos por pertencerem ao metabolismo basal sendo dessa forma, de fácil identificação fenotípica e
de importante efeito no caso de sileciamento gênico. Os genes HPPD (4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase) para PDS (Phytoene desaturase) do arroz
(Oryza sativa L.) serão obtidos no banco do genoma do arroz The Rice Annotation Project (RAP) database (https://rapdb.dna.affrc.go.jp/).
Para o desenvolvimento de moléculas de dsRNA que sejam capazes de ativar o sistema de RNAi, serão utilizados fragmentos de 200, 400, 600 e
800pb. Os fragmentos serão obtidos utilizando dois conjuntos de oligonucleotideos: o primeiro flanqueia a região específica em relação ao tamanho
do amplicon desejado na CDS (região codificante do gene) enquanto o segundo conjunto servirá para inserir a mínima sequência requerida do
promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') ao fragmento amplificado com o primeiro conjunto de oligonucleotídeos.
Para o desenvolvimento das moléculas de dsRNA, os fragmentos referentes aos targets serão obtidas a partir de uma biblioteca
de cDNA, para evitar a presença de introns, utilizando os oligonucleotídeos específicos. Com a biblioteca de cDNA, serão
realizadas as reações de amplificação dos fragmentos correspondente aos targets.
A síntese das moléculas de dsRNA será realizada utilizando os fragmentos específicos já com a região T7 obtidos nas reações de
amplificação. Os fragmentos serão convertidos em dsRNAs utilizando o kit MEGAscript® RNAi (Ambion). Após os dsRNAs serão
verificados quanto a presença e integridade em eletroforese em gel de agarose.
A eficiência de entrega do dsRNA será acessada através de diferentes formas de introdução das moléculas de dsRNA. Os testes
serão realizados em ambiente controlado expondo a raiz de plântulas de arroz (estadio V3) a solução contendo o dsRNA, através
da injeção das moléculas em folhas das plântulas e através de injuria foliar induzida com material perfuro cortante. A eficiência de
ativação será verificada a partir da análise fenotípica da planta, acessando o fenótipo esperado e através de qRT-PCR. Os
fragmentos que forem capazes de ativar o sistema RNAi e silenciar com eficiência e especificidade os genes alvo, serão
selecionados para a síntese de MdsRNA. A síntese das moléculas será realizada pela Startup NanoSur (http://www.nanosur.com/)
em Miami nos EUA. As moléculas de MdsRNA serão testadas conforme descrito para os testes das moléculas de dsRNA
sintetizadas in house.

Atividade 2 – Desenvolvimento de dsRNAs para o controle de insetos
Serão selecionados genes-alvo candidatos que, ao serem silenciados, resultem na morte, reversão de resistência a inseticidas
sintéticos ou modificação morfológica que impeçam ou reduzam o dano do inseto-praga na cultura. Estes genes-alvo serão
buscados em bancos de dados de RNA-seq. O dsRNA será obtido a aprtir da amplificação de uma bibilioteca de cDNAs utilinzando
oligonucleotideos especificos para os genes alvo.
Os insetos serão injetados com dsRNA, seguindo uma metodologia adaptada de Prentice et al. (2017). Os insetos microinjetados
serão utilizados para montagem de ensaio de letalidade e para quantificação da expressão gênica em qRT-PCR. Os genes-alvo
candidatos mais responsivos ao silenciamento gênico nos ensaios de microinjeção serão avaliados novamente, por via oral. Será
realizada a quantificação da expressão gênica, como descrito anteriormente.
Silenciamento gênico induzido por vírus será realizado a partir das leituras brutas de RNAseq. Os domínios funcionais das espécies
de vírus identificadas serão anotados usando o software Interproscan (JONES et al., 2014). As espécies de vírus predominantes
serão selecionadas para as próximas etapas do projeto. Será realizado o isolamento das partículas virais dos vírus selecionados a
partir da homogeneização de insetos infectados em tampão adequado e ultracentrifugação. Uma alíquota do isolado será utilizada
para extração de RNA, síntese de cDNA e PCR com primers desenhados para a confirmação da presença dos vírus selecionados
nos isolados. Com uma alíquota do isolado, serão realizados ensaios de infectividade in vitro e in vivo. Os ensaios in vitro serão
realizados em placas de seis poços, através da adição do isolado viral nos poços contendo meio de cultura e células das linhagens
S2 (Drosophila melanogaster) e Sf9 (Spodoptera frugiperda). A viabilidade celular será realizada através da contagem de células
antes e durante o ensaio. A carga viral será aferida através da extração de RNA celular, síntese de cDNA e quantificação por PCR
em tempo real (qPCR) utilizando primers específicos para cada espécie de vírus selecionadas. Para realização dos ensaios in vivo,
será fornecida dieta artificial misturada com uma alíquota do isolado viral para insetos imaturos. Serão aferidas a mortalidade e a
carga viral diariamente. As amostras de cDNA sintetizadas na seção anterior serão utilizadas para amplificação do genoma viral
completo, usando um par de primers desenhados com sítios de restrição específicos não encontrados no genoma do vírus ou no
plasmídeo ao qual ele será ligado. A ligação do genoma viral será realizada em um plasmídeo vetor de expressão, contendo
sequência promotora T7 em posição upstream da região de múltipla clonagem (MCS). O plasmídeo com o genoma do vírus será
modificado, com a inserção de uma sequência completa da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) e de sequencias de
ribozimas auto cliváveis nas extremidades do genoma. Os plasmídeos modificados serão utilizados para transcrição in vitro com
enzima T7 RNA polimerase, seguindo as instruções do fabricante. Os transcritos serão preparados com reagente específico para
formação de lipossomos e transfecção em linhagem celular adequada ou em insetos inteiros.
O clone infeccioso obtido na etapa anterior será modificado, com a inserção de uma região MCS contendo sítios de restrição. Essa
região será utilizada para introdução das sequencias dos genes-alvo específicos para silenciamento no inseto-alvo. Sequencias de
200-300 nucleotídeos pertencentes aos genes-alvo serão amplificados, com primers contendo sítios de restrição diferentes em
ambas as terminações. Os sítios de restrição inseridos serão os mesmos presentes na região MCS inserida no clone infeccioso,
permitindo a ligação das sequencias do gene-alvo. Após realização de transformação, clonagem e purificação dos vetores virais
contendo os genes alvo, estes serão utilizados para produção de partículas virais em linhagem celular adequada ou em insetos
vivos, via transfecção. As partículas virais produzidas serão purificadas por centrifugação e utilizadas para avaliar a eficiência do
silenciamento no inseto-alvo, em decorrência da infecção e replicação do vírus modificado. As partículas virais recombinantes
serão fornecidas por alimentação para insetos imaturos. Um tratamento de controle será estabelecido com o fornecimento de
dieta com partículas virais não modificadas, e um segundo controle com insetos imaturos em dieta artificial sem vírus. Os insetos
serão mantidos por 10 dias nas respectivas dietas. A mortalidade será avaliada diariamente e 8 insetos serão coletados por dia
para extração de RNA, sínese de cDNA e reação de qPCR para quantificar a expressão dos genes-alvo nos insetos tratados.

Atividade 3 – Formulação de conjugantes
O nanoencapsulamento de agentes bioativos como o RNA interferente (RNAi) poderá ser feito utilizando, por exemplo,
vesículas poliméricas, nas quais o agente bioativo aloja-se no seu interior da mesma. Ainda, poderão ser utilizadas nanopartículas
poliméricas sólidas, as quais atuam como reservatório do material encapsulado controlando assim a sua liberação. Para formulação desses sistemas de nanoencapsulamento serão utilizados polímeros de origem natural ou sintética.
Dentre esses, o polietilenoglicol, a poli--caprolactona, a quitosana, a celulose e o alginato serão testados como materiais de
partida. A modificação da estrutura desses polímeros também ampliará o escopo de trabalho uma vez que novas propriedades e
novos materiais poderão ser preparados.
Com relação à formação dos sistemas nanoparticulados, esses serão produzidos por diferentes técnicas dentre as quais
podemos mencionar processos de auto-montagem ou sistemas de emulsão. Esses métodos são amplamente descritos na
literatura como sendo maneiras eficientes para obtenção de materiais em escala nanométrica. Vale ressaltar que a escolha do
método levará em consideração fatores como tipo de polímero, tipo de aplicação e característica do agente ativo que será
encapsulado. Sendo assim, um planejamento cuidadoso será realizado junto com toda a equipe técnica a fim de que o processo
de nanoencapsulamento do RNAi seja eiciente.

Meta M1: Busca dos genes alvo
Resultado M1.1: busca dos genes alvo;
Resultado M1.2: Teste do sistema;
Resultado M1.3: Elaboração do RNAi;
Resultado M1.4: Testes por funcionalidade;
Meta M2: Teste de eficiência e seletividade
Resultado M2.1: Teste em casa de vegetação;
Resultado M2.2: Processamento dos dados e publicação;