Nome do Projeto
Potencial terapêutico do extrato de mirtilo em transtornos psiquiátricos: investigação em modelos experimentais de mania e depressão
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/10/2020 - 01/10/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
O transtorno depressivo maior (TDM) e o transtorno afetivo bipolar (TAB) são distúrbios neuropsiquiátricos crônicos e altamente incapacitantes. Apesar do grande impacto negativo dessas doenças, ainda existe uma lacuna acerca dos mecanismos fisiopatológicos e tratamento. Sendo assim, torna-se crucial entender melhor a neurobiologia, bem como buscar novas alternativas terapêuticas. Nesse contexto, destaca-se o mirtilo (Vaccinium spp.), fruto que apresenta em sua composição polifenois com ação neuroprotetora. Considerando o exposto, o objetivo desse estudo será investigar o efeito da administração de extrato de mirtilo em parâmetros comportamentais e bioquímicos em animais submetidos aos modelos experimentais de mania e de depressão. Para o protocolo experimental de mania serão utilizados ratos Wistar adultos, os quais serão tratados durante 14 dias com lítio (45 mg/kg duas vezes ao dia) ou extrato de mirtilo (200 mg/kg) via oral; no 15º dia receberão a cetamina (25 mg/kg) via intraperitoneal e serão submetidos ao teste do campo aberto. Para o protocolo experimental de depressão serão utilizados camundongos Swiss adultos, estes serão tratados durante 7 dias com fluoxetina (20 mg/kg) ou extrato de mirtilo (100 ou 200 mg/kg) via oral; no 7º dia receberão o lipopolissacarídeo (0,83 mg/kg) via intraperitoneal e após 24 horas serão submetidos aos testes comportamentais. Para ambos os protocolos, após os testes comportamentais, os animais serão submetidos à eutanásia, onde o córtex cerebral, o estriado e o hipocampo serão coletados. Serão avaliados parâmetros de estresse oxidativo, neuroinflamação e fatores neurotróficos, bem como a disfunção mitocondrial e a neurotransmissão serotoninérgica. Espera-se, com o estudo pré-clínico dos episódios de mania e de depressão, colaborar com a elucidação dos mecanismos neurobiológicos associados aos transtornos de humor e evidenciar o potencial neuroprotetor do extrato de mirtilo.

Objetivo Geral

Investigar o efeito da administração de extrato de mirtilo em parâmetros comportamentais e bioquímicos em animais submetidos aos modelos experimentais de mania e de depressão.

Justificativa

O transtorno depressivo maior (TDM) e o transtorno afetivo bipolar (TAB) são distúrbios neuropsiquiátricos crônicos e altamente incapacitantes. Apesar do grande impacto negativo dessas doenças, ainda existe uma lacuna acerca dos mecanismos fisiopatológicos e tratamento. Sendo assim, torna-se crucial entender melhor a neurobiologia, bem como buscar novas alternativas terapêuticas.
Tendo em vista que a fisiopatologia tanto do TDM quanto do TAB é multifatorial e pouco precisa, é razoável aceitar que uma mistura de compostos, como o extrato de mirtilo, terá uma maior atividade biológica do que um único composto, pela sua capacidade de interagir com variados alvos. Assim, neste estudo, o objetivo será investigar o papel neuroprotetor de um extrato bruto de mirtilo frente às disfunções induzidas por modelos experimentais de mania e de depressão. Espera-se que o desenvolvimento destes estudos possa auxiliar na compreensão dos mecanismos subjacentes a essas doenças bem como, futuramente, na evolução das opções de tratamento.

Metodologia

METODOLOGIA
Animais e aspectos éticos
Os procedimentos envolvendo os animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) sob os seguintes códigos: 9085-2016 e 32979-2019.

Preparação do extrato de mirtilo
Os frutos de mirtilo (Vaccinium virgatum) serão obtidos da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária de Clima Temperado (EMBRAPA), localizada no município de Pelotas sendo que o extrato será preparado de acordo com Bordignon e colaboradores (2009).

Protocolo experimental de mania e prevenção com extrato de mirtilo
Serão utilizados ratos Wistar (250-300g, 60 dias), os quais serão divididos em quatro grupos experimentais: I (controle), II (cetamina 25 mg/kg), III (cetamina 25 mg/kg e carbonato de lítio 45 mg/kg duas vezes ao dia) e IV (cetamina 25 mg/kg e extrato de mirtilo 200 mg/kg). Os animais receberão água, carbonato de lítio ou extrato de mirtilo via oral durante 14 dias. Do 8º ao 14º dia, os animais dos grupos II, III e IV também receberão cetamina via intraperitoneal, enquanto os animais do grupo I receberão solução salina. No 15º dia do protocolo, os animais receberão uma única injeção de cetamina ou de solução salina. Após trinta minutos a atividade locomotora será avaliada utilizando o teste comportamental do campo aberto. Posteriormente, será realizada a eutanásia dos animais, onde o cérebro será retirado e dissecado em córtex cerebral, hipocampo e estriado. Essas estruturas serão armazenadas à -80°C até a realização das análises bioquímicas. As doses de carbonato de lítio, extrato de mirtilo e de cetamina estão de acordo com estudos prévios da literatura (GAZAL et al., 2014; DEBOM et al., 2016; SPOHR et al., 2019).

Teste do campo aberto no modelo experimental de mania
O teste comportamental do campo aberto será usado para avaliar a atividade locomotora dos animais. Este consiste em uma caixa de madeira medindo 72 x 72 x 22 cm (largura x comprimento x altura), sendo a base dividida em 16 quadrantes iguais (18 x 18 cm). Para a realização do teste, os animais serão colocados individualmente em um dos quatro cantos do aparato e o número de quadrantes cruzados será mensurado durante um período de 5 minutos para a avaliação da locomoção. O aparato será limpo com etanol 40% e seco após cada sessão individual.

Avaliação dos parâmetros bioquímicos de animais submetidos ao modelo de mania e tratados com mirtilo
A atividade dos complexos I, II, III e IV da cadeia transportadora de elétrons será determinada de acordo com a metodologia de Spinazzi et al., (2012). Os resultados serão expressos como nmol/min mg de proteína. A atividade da citrato-sintase será determinada mensurando a redução do ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) a 412 nm, de acordo com a metodologia descrita por Shepherd e Garland (1969).
Os níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) serão avaliados utilizando o kit comercial ChemiKine BDNF Sandwich ELISA, CYT306 (Chemicon/Millipore, Billerica, MA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.
A concentração extracelular de trifosfato de adenosina (ATP) será quantificada por bioluminescência utilizando o kit comercial de determinação de ATP Molecular Probes®/Invitrogen (Cat. No. A22066, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções do fabricante.

Protocolo experimental de depressão e prevenção com extrato de mirtilo
Serão utilizados camundongos Swiss (40-50g, 60 dias), os quais serão divididos em cinco grupos experimentais: I (controle), II (LPS 0,83 mg/kg), III (LPS e fluoxetina 20 mg/kg), IV (LPS e extrato de mirtilo 100 mg/kg) e V (LPS e extrato de mirtilo 200 mg/kg). Durante sete dias os animais receberão água, fluoxetina ou extrato de mirtilo via oral. No 7º dia, os animais dos grupos II, III, IV e V também receberão via intraperitoneal uma injeção de LPS, enquanto os do grupo I receberão água. Após 24 horas da injeção, os animais serão submetidos aos seguintes testes comportamentais: campo aberto, nado forçado, suspensão da cauda e borrifagem de sacarose. Posteriormente, será realizada a eutanásia dos animais, onde o cérebro será retirado e dissecado em córtex cerebral, hipocampo e estriado. Essas estruturas serão armazenadas à -80°C até a realização das análises bioquímicas. As doses de fluoxetina, extrato de mirtilo e de LPS estão de acordo com estudos prévios da literatura.

Testes comportamentais no modelo de depressão
O teste comportamental do campo aberto será usado para avaliar a atividade locomotora dos animais. Este consiste em uma caixa de madeira medindo 72 x 72 x 22 cm (largura x comprimento x altura), sendo a base dividida em 16 quadrantes iguais (18 x 18 cm). Para a realização do teste, os animais serão colocados individualmente em um dos quatro cantos do aparato e o número de quadrantes cruzados será mensurado durante um período de 5 minutos para a avaliação da locomoção. O aparato será limpo com etanol 40% e seco após cada sessão individual.
O teste do nado forçado será utilizado para avaliar o comportamento tipo-depressivo dos animais. (PORSOLT et al., 1977). Nesse teste, os animais serão colocados individualmente em um cilindro medindo 10 x 25 cm (diâmetro x altura), com água na profundidade de 8 cm e temperatura média de 25°C. Após 2 minutos de período de habituação (tempo de latência para o primeiro episódio de imobilidade), o tempo de imobilidade (em segundos) será observado durante 4 minutos. Os camundongos serão considerados imóveis quando deixarem de realizar qualquer movimento, como nadar, mergulhar e escalar, sendo necessários apenas movimentos para manter a cabeça ou o nariz acima da água. Ao terminar o teste, a água era trocada e cada animal era retirado do cilindro e seco com toalha.
O teste da suspensão da cauda será realizado para avaliar o comportamento tipo-depressivo dos animais (STERU et al., 1985). Os camundongos serão suspensos pela cauda, cerca de 50 cm do chão, com o auxílio de uma fita adesiva. Após 2 minutos de período de adaptação, o tempo de imobilidade individual (definido como a ausência de comportamento de tentativa de fuga), em segundos, será mensurado durante um período de 4 minutos.
O teste de borrifagem de sacarose será realizado para a avaliação do comportamento tipo-depressivo, demonstrado pelo tempo de autolimpeza dos animais (YALCIN et al., 2008). Esse teste consiste na borrifagem de uma solução de água contendo 10% de sacarose no dorso do camundongo, seguida da alocação do mesmo em um funil de vidro, permitindo assim a observação do animal. Após a aplicação da solução de sacarose, a latência para o início da autolimpeza e o tempo total de autolimpeza serão mensurados durante um período de 5 minutos. O aparato utilizado será limpo com uma solução de álcool 40% entre cada sessão individual.

Avaliação de parâmetros de estresse oxidativo no modelo de depressão

Serão avaliados em estruturas cerebrais dos camundongos: determinação de espécies reativas de oxigênio (ERO) (ALI et al., 1992); níveis de nitrito (STUEHR & NATHAN, 1989); determinação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (ESTERBAUER e CHEESEMAN’S, 1990); conteúdo tiólico total (AKSENOV e MARKESBERY, 2001), atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) (MISRA e FRIDOVICH, 1972); catalase (AEBI, 1984) e gluationa peroxidase (kit comercial da Randox Laboratories (RANSEL®, United Kingdom).

Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)
Os níveis de BDNF serão avaliados utilizando-se o kit comercial ChemiKine BDNF Sandwich ELISA Kit, CYT306 (Chemicon/Millipore, Billerica, MA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

Determinação dos níveis do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
A determinação dos níveis de TNF-α será realizada usando kit de ensaio imunoenzimático (ELISA) adquiridos da BD Biosciences. A concentração de TNF-α nas amostras será determinada de acordo com as instruções do fabricante e lida a 450 nm. Os níveis de TNF-α serão expressos como pg/mg de proteína.

Determinação da atividade da monoamina oxidase A (MAO-A)
A atividade da MAO-A será determinada de acordo com metodologia descrita por Krajl (1965) com algumas modificações de Matsumoto et al., (1984). A intensidade da fluorescência será detectada através de espectrofotômetro com excitação a 315 nm e emissão a 380 nm. A atividade da enzima será expressa como nmol de 4-hidroxiquinolina/mg de proteína/min.

Determinação dos níveis cerebrais de serotonina
Os níveis cerebrais de serotonina serão determinados pelo método de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (HPLC-ED).

Determinação da expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias e do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-κB)
A quantificação da expressão dos genes das citocinas IL-1β, IL-6, IL-4 e IL-10, bem como do NF-κB será realizada por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).

Análise estatística
A análise estatística será realizada por análise de variância (ANOVA) de uma via seguida do teste de Tukey utilizando o programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, São Diego, CA). Será considerada uma diferença significativa quando P<0,05. Todos os dados serão expressos com média ± erro padrão.

Indicadores, Metas e Resultados

Estudos prévios do nosso grupo de pesquisa buscaram esclarecer a fisiopatologia do TAB utilizando o modelo animal de mania induzido com a cetamina, bem como demonstrar o papel neuroprotetor do extrato de mirtilo frente às alterações encontradas durante esse episódio. Os resultados prévios demonstraram que o extrato de mirtilo possui atividade antioxidante e foi capaz de prevenir alterações nas enzimas Na+,K+-ATPase e acetilcolinesterase (AChE) em estruturas cerebrais.
Considerando os resultados promissores observados, pretende-se seguir avaliando o potencial do extrato de mirtilo frente ao episódio maníaco, mas também observar a atividade desse extrato nas alterações encontradas durante o episódio depressivo. Assim, pretende-se evidenciar o papel neuroprotetor do mirtilo frente ao TAB, bem como ao TDM, doenças neuropsiquiátricas que ainda não apresentam um adequado tratamento. Além disso, busca-se melhor entender os mecanismos envolvidos com esses complexos transtornos, possibilitando o desenvolvimento de terapias mais eficazes que proporcionem uma adequada qualidade de vida aos portadores.

Além disso, este projeto faz parte de uma tese de doutorado, desta forma, contribuirá também para a formação de pessoal qualificado. Estima-se também a publicação de pelo menos 03 artigos científicos associados ao resultados do projeto bem como a apresentação de trabalhos em congressos da área, divulgando assim os achados deste estudo para a comunidade científica.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANITA AVILA DE SOUZA
CLAITON LEONETI LENCINA1
FERNANDO LOPEZ ALVEZ
FRANCIELI MORO STEFANELLO1
JULIA EISENHARDT DE MELLO
KARINA PEREIRA LUDUVICO
LUIZA SPOHR
MAYARA SANDRIELLY PEREIRA SOARES2
NATHALIA STARK PEDRA
NATÁLIA PONTES BONA
ROSELIA MARIA SPANEVELLO2
Sara Keske

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 4.500,00Coordenador

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