METODOLOGIA
Animais e aspectos éticos
Os procedimentos envolvendo os animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) sob os seguintes códigos: 9085-2016 e 32979-2019.
Preparação do extrato de mirtilo
Os frutos de mirtilo (Vaccinium virgatum) serão obtidos da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária de Clima Temperado (EMBRAPA), localizada no município de Pelotas sendo que o extrato será preparado de acordo com Bordignon e colaboradores (2009).
Protocolo experimental de mania e prevenção com extrato de mirtilo
Serão utilizados ratos Wistar (250-300g, 60 dias), os quais serão divididos em quatro grupos experimentais: I (controle), II (cetamina 25 mg/kg), III (cetamina 25 mg/kg e carbonato de lítio 45 mg/kg duas vezes ao dia) e IV (cetamina 25 mg/kg e extrato de mirtilo 200 mg/kg). Os animais receberão água, carbonato de lítio ou extrato de mirtilo via oral durante 14 dias. Do 8º ao 14º dia, os animais dos grupos II, III e IV também receberão cetamina via intraperitoneal, enquanto os animais do grupo I receberão solução salina. No 15º dia do protocolo, os animais receberão uma única injeção de cetamina ou de solução salina. Após trinta minutos a atividade locomotora será avaliada utilizando o teste comportamental do campo aberto. Posteriormente, será realizada a eutanásia dos animais, onde o cérebro será retirado e dissecado em córtex cerebral, hipocampo e estriado. Essas estruturas serão armazenadas à -80°C até a realização das análises bioquímicas. As doses de carbonato de lítio, extrato de mirtilo e de cetamina estão de acordo com estudos prévios da literatura (GAZAL et al., 2014; DEBOM et al., 2016; SPOHR et al., 2019).
Teste do campo aberto no modelo experimental de mania
O teste comportamental do campo aberto será usado para avaliar a atividade locomotora dos animais. Este consiste em uma caixa de madeira medindo 72 x 72 x 22 cm (largura x comprimento x altura), sendo a base dividida em 16 quadrantes iguais (18 x 18 cm). Para a realização do teste, os animais serão colocados individualmente em um dos quatro cantos do aparato e o número de quadrantes cruzados será mensurado durante um período de 5 minutos para a avaliação da locomoção. O aparato será limpo com etanol 40% e seco após cada sessão individual.
Avaliação dos parâmetros bioquímicos de animais submetidos ao modelo de mania e tratados com mirtilo
A atividade dos complexos I, II, III e IV da cadeia transportadora de elétrons será determinada de acordo com a metodologia de Spinazzi et al., (2012). Os resultados serão expressos como nmol/min mg de proteína. A atividade da citrato-sintase será determinada mensurando a redução do ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) a 412 nm, de acordo com a metodologia descrita por Shepherd e Garland (1969).
Os níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) serão avaliados utilizando o kit comercial ChemiKine BDNF Sandwich ELISA, CYT306 (Chemicon/Millipore, Billerica, MA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.
A concentração extracelular de trifosfato de adenosina (ATP) será quantificada por bioluminescência utilizando o kit comercial de determinação de ATP Molecular Probes®/Invitrogen (Cat. No. A22066, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções do fabricante.
Protocolo experimental de depressão e prevenção com extrato de mirtilo
Serão utilizados camundongos Swiss (40-50g, 60 dias), os quais serão divididos em cinco grupos experimentais: I (controle), II (LPS 0,83 mg/kg), III (LPS e fluoxetina 20 mg/kg), IV (LPS e extrato de mirtilo 100 mg/kg) e V (LPS e extrato de mirtilo 200 mg/kg). Durante sete dias os animais receberão água, fluoxetina ou extrato de mirtilo via oral. No 7º dia, os animais dos grupos II, III, IV e V também receberão via intraperitoneal uma injeção de LPS, enquanto os do grupo I receberão água. Após 24 horas da injeção, os animais serão submetidos aos seguintes testes comportamentais: campo aberto, nado forçado, suspensão da cauda e borrifagem de sacarose. Posteriormente, será realizada a eutanásia dos animais, onde o cérebro será retirado e dissecado em córtex cerebral, hipocampo e estriado. Essas estruturas serão armazenadas à -80°C até a realização das análises bioquímicas. As doses de fluoxetina, extrato de mirtilo e de LPS estão de acordo com estudos prévios da literatura.
Testes comportamentais no modelo de depressão
O teste comportamental do campo aberto será usado para avaliar a atividade locomotora dos animais. Este consiste em uma caixa de madeira medindo 72 x 72 x 22 cm (largura x comprimento x altura), sendo a base dividida em 16 quadrantes iguais (18 x 18 cm). Para a realização do teste, os animais serão colocados individualmente em um dos quatro cantos do aparato e o número de quadrantes cruzados será mensurado durante um período de 5 minutos para a avaliação da locomoção. O aparato será limpo com etanol 40% e seco após cada sessão individual.
O teste do nado forçado será utilizado para avaliar o comportamento tipo-depressivo dos animais. (PORSOLT et al., 1977). Nesse teste, os animais serão colocados individualmente em um cilindro medindo 10 x 25 cm (diâmetro x altura), com água na profundidade de 8 cm e temperatura média de 25°C. Após 2 minutos de período de habituação (tempo de latência para o primeiro episódio de imobilidade), o tempo de imobilidade (em segundos) será observado durante 4 minutos. Os camundongos serão considerados imóveis quando deixarem de realizar qualquer movimento, como nadar, mergulhar e escalar, sendo necessários apenas movimentos para manter a cabeça ou o nariz acima da água. Ao terminar o teste, a água era trocada e cada animal era retirado do cilindro e seco com toalha.
O teste da suspensão da cauda será realizado para avaliar o comportamento tipo-depressivo dos animais (STERU et al., 1985). Os camundongos serão suspensos pela cauda, cerca de 50 cm do chão, com o auxílio de uma fita adesiva. Após 2 minutos de período de adaptação, o tempo de imobilidade individual (definido como a ausência de comportamento de tentativa de fuga), em segundos, será mensurado durante um período de 4 minutos.
O teste de borrifagem de sacarose será realizado para a avaliação do comportamento tipo-depressivo, demonstrado pelo tempo de autolimpeza dos animais (YALCIN et al., 2008). Esse teste consiste na borrifagem de uma solução de água contendo 10% de sacarose no dorso do camundongo, seguida da alocação do mesmo em um funil de vidro, permitindo assim a observação do animal. Após a aplicação da solução de sacarose, a latência para o início da autolimpeza e o tempo total de autolimpeza serão mensurados durante um período de 5 minutos. O aparato utilizado será limpo com uma solução de álcool 40% entre cada sessão individual.
Avaliação de parâmetros de estresse oxidativo no modelo de depressão
Serão avaliados em estruturas cerebrais dos camundongos: determinação de espécies reativas de oxigênio (ERO) (ALI et al., 1992); níveis de nitrito (STUEHR & NATHAN, 1989); determinação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (ESTERBAUER e CHEESEMAN’S, 1990); conteúdo tiólico total (AKSENOV e MARKESBERY, 2001), atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) (MISRA e FRIDOVICH, 1972); catalase (AEBI, 1984) e gluationa peroxidase (kit comercial da Randox Laboratories (RANSEL®, United Kingdom).
Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)
Os níveis de BDNF serão avaliados utilizando-se o kit comercial ChemiKine BDNF Sandwich ELISA Kit, CYT306 (Chemicon/Millipore, Billerica, MA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.
Determinação dos níveis do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
A determinação dos níveis de TNF-α será realizada usando kit de ensaio imunoenzimático (ELISA) adquiridos da BD Biosciences. A concentração de TNF-α nas amostras será determinada de acordo com as instruções do fabricante e lida a 450 nm. Os níveis de TNF-α serão expressos como pg/mg de proteína.
Determinação da atividade da monoamina oxidase A (MAO-A)
A atividade da MAO-A será determinada de acordo com metodologia descrita por Krajl (1965) com algumas modificações de Matsumoto et al., (1984). A intensidade da fluorescência será detectada através de espectrofotômetro com excitação a 315 nm e emissão a 380 nm. A atividade da enzima será expressa como nmol de 4-hidroxiquinolina/mg de proteína/min.
Determinação dos níveis cerebrais de serotonina
Os níveis cerebrais de serotonina serão determinados pelo método de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (HPLC-ED).
Determinação da expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias e do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-κB)
A quantificação da expressão dos genes das citocinas IL-1β, IL-6, IL-4 e IL-10, bem como do NF-κB será realizada por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).
Análise estatística
A análise estatística será realizada por análise de variância (ANOVA) de uma via seguida do teste de Tukey utilizando o programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, São Diego, CA). Será considerada uma diferença significativa quando P<0,05. Todos os dados serão expressos com média ± erro padrão.