Nome do Projeto
Atividade in vitro de extratos de macrofungos sobre Pythium insidiosum
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/11/2020 - 30/07/2022
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
P. insidiosum é um agente etiológico da pitiose, enfermidade que atinge o tecido subcutâneo de mamíferos que habitam regiões tropicais, subtropicais e temperadas. O desenvolvimento de Pythium sp. depende de fatores abióticos no ecossistema, como áreas alagadas e temperatura. Podem ser sapróbios ou parasitas de animais e plantas. Os equinos são os mais atingidos no Brasil, considerado país endêmico da doença. O presente estudo pretende caracterizar o potencial antimicrobiano in vitro de extratos de macrofungos silvestres do sul do Brasil sobre isolados de Pythium insidiosum Serão realizadas coletas das espécies dos macrofungos Lactarius deliciosus, Laccaria laccata e Auricularia auricula em três regiões localizadas no sul do estado do Rio Grande do Sul. Serão produzidos extratos aquosos, etanólicos e hidro-alcoólicos a partir das espécies de basidiomicetos coletados e armazenados sob desidratação e congelamento. Os testes de suscetibilidade in vitro serão realizados frente a 20 isolados de P. insidiosum empregando a técnica de microdiluição e seguindo o protocolo M38-A2 do CLSI. O presente trabalho visa uma nova alternativa de compostos a serem utilizados e acrescentar descobertas a respeito das possíveis espécies de macrofugnos que tenham compostos bioativos com potencial antagonista ao oomiceto

Objetivo Geral

Avaliar a atividade in vitro de extratos de macrofungos silvestres do sul do Brasil sobre isolados de Pythium insidiosum

Justificativa

Pythium sp. é um oomiceto, classificado taxonomicamente na Família Pythiaceae, Ordem Pythiales, Classe Oomycetes e Reino Straminipila (SANTURIO et al., 2006; KIRK et al., 2008). O gênero apresenta organismos de reprodução assexuada, caracterizada pela produção de zoósporos biflagelados (SANTURIO et al., 2004). As espécies sapróbias podem crescer no solo, locais alagados e na matéria orgânica em decomposição, ou podem ser parasitas de animais e plantas (BHALERAO et al., 2020; RAI et al.; 2020; VALENTE, 2020).
O desenvolvimento de Pythium sp. depende de fatores abióticos no ecossistema ao qual faz parte (SANTURIO et al., 2006), como áreas alagadas e temperatura (ZAMBRANO et al., 2017; ZARO et al., 2018). O oomiceto cresce otimamente a 28ºC e mais lentamente a 32ºC e 37ºC (KRAJAEJUN et al., 2010). Zambrano et al. (2017) evidenciou in vitro que Pythium insidiosum tem viabilidade entre temperaturas de 5ºC e 15ºC, porém em temperaturas mais altas entre 20ºC e 37ºC o processo de zoosporogênese é induzido liberando os zoósporos. A espécie P. insidiosum é o agente etiológico causador da pitiose, uma doença emergente que atinge predominantemente o tecido subcutâneo de mamíferos em regiões tropicais, subtropicais e temperadas (LEAL et al., 2001; SANTURIO et al., 2006; GAASTRA et al., 2010; KRAJAEJUN et al., 2018; RAI et al., 2020).
Já foram relatadas afecções em equinos, canídeos, felinos, bovinos, caprinos, animais silvestres e humanos (LEAL et al., 2001; SANTURIO et al., 2006; KRAJAEJUN et. al., 2018; ZARO et al., 2018; DOWST et al., 2019; PERMPALUNG et al., 2019; RAI et al., 2020). No entanto, convém ressaltar que a espécie equina é a mais atingida, principalmente no Brasil, considerado área endêmica da doença e com o maior número de casos relatados para a espécie (LEAL et al., 2001; SANTURIO et al., 2006; MARCOLONGO-PEREIRA et al., 2012; ZARO et al., 2018; ROSSATO et al., 2018; RAI et al.; 2020). A pitiose equina é descrita em diversos países da América Latina, com potencial para circular em grandes áreas no Uruguai e Rio Grande do Sul, Brasil (MACHADO et al., 2018; ROMERO, et al., 2019). Apesar disso, nas últimas décadas, a pitiose tem sido objeto de estudo para todos os mamíferos que possivelmente entram em contato com o agente em ambientes alagados (SANTURIO et al., 2006; ZARO et al., 2018).
A pitiose está associada ao nicho ecológico de P. insidiosum, principalmente áreas alagadas, reservatórios de água, água de irrigação e solo, que são reservatórios naturais do oomiceto (SUPABANDHU, 2008; VANITTANAKOM, 2014). Condições como estações chuvosas também são determinantes para ocorrência de pitiose em algumas regiões (MARCOLONGO-PEREIRA et al., 2012). Em áreas agrícolas endêmicas da Tailândia esses ambientes podem ser uma importante fonte de infecção por P. insidiosum para trabalhadores rurais (SUPABANDHU, 2008; VANITTANAKOM, 2014). Existem indicações de que o nicho ambiental de P. insidiosum está em expansão, pois já foi relatado em clima árido ou semiárido, e pode estar relacionado com as alterações ambientais, como inundações de campos de arroz ou desenvolvimento irrigado da paisagem (GAASTRA et al., 2010). Outro fator muito preocupante é a adaptação de P. insidiosum a climas mais temperados, onde Mendoza (2009) sugere que a expansão de seu nicho ecológico está relacionado com a intensificação do aquecimento global.
Já se sabe que o aumento de exsudatos no solo, principalmente pela adubação das plantas com excesso de nitrogênio ou aplicações de agroquímicos, atuam de forma a estimular a germinação de microrganismos patogênicos, incluindo Pythium sp. (TOKESHI, 2000). Os agrotóxicos e insumos químicos também têm gerado diversos impactos ecológicos e ambientais (TOKESHI, 2000; SPADOTTO et al., 2004; CARNEIRO et al., 2015), especialmente quando a resposta evolutiva de bactérias, fungos e parasitas à pressão seletiva exercida sobre eles, estabelece resistência aos agrotóxicos, como fungicidas (SPADOTTO et al., 2004; CARNEIRO et al., 2015). Constata-se também que existe essa mesma relação de resistência dos fungos e bactérias aos antibióticos (SHELDON JR, 2003).
As terapias disponíveis para o tratamento da pitiose em animais e humanos, incluindo a cirurgia, imunoterapia, nanopartículas de prata e agentes antimicrobianos (KRAJAEJUM et al., 2006; FONSECA, 2015, LORETO et al. 2019; VALENTE et al., 2019; IANISKI et al., 2020) demonstram respostas bastante variáveis, com relatos de sucessos e insucessos terapêuticos (GAASTRA et al., 2010). P. insidiosum não responde bem aos antifúngicos convencionais, assim como os azólicos e a anfortericina B. Esse fato está associado à falta de ergosterol na membrana citoplasmática e o que diferencia esse oomiceto de fungos verdadeiros (MENDOZA & NEWTON, 2005; SANTURIO et al., 2006; GAASTRA, 2010; MENDOZA; VILELA, 2013; ARAÚJO et al., 2016; PERMPALUNG et al., 2019).
Portanto, o interesse por substâncias naturais com atividade biológica e potencial antagônico aos micro-organismos patogênicos têm atraído estudos que buscam descobrir novos compostos com alta eficácia e baixa toxicidade (SHIAO et al., 1994; SHELDON JR, 2003; ARAÚJO et al., 2016; VOLCÃO et al., 2019). Os macrofungos pertencentes ao filo Basidiomycota são conhecidos por suas estruturas de reprodução que formam basidiomas (PUTZKE, 2015). Esses organismos participam de funções ecológicas e biológicas fundamentais nos ciclos biogeoquímicos e cadeias tróficas (ANTUNES & KOYAMA, 2017; INNOCENTI & SABATINI, 2018; TIMM, 2018), além de também atuar no controle populacional de espécies do ambiente como antagonistas naturais e atrair ou repelir organismos do solo (BALDIN et al., 2011; DEGENKOLB & VILCINSKAS, 2016; GONZÁLEZ et al., 2017; INNOCENTI & SABATINI, 2018).
Os macrofungos silvestres possuem propriedades biológicas ativas com potencialidades para o desenvolvimento de novas categorias de compostos para o controle de organismos patogênicos (PETRE, 2015; VOLCÃO et al., 2019). Dentre estes, é importante destacar as espécies de basidiomicetos Auricularia auricula, Lactarius deliciosus e Laccaria laccata que apresentam atividades antioxidantes, assim como demonstram possuir propriedades antimicrobianas contra Acinetobacter baumanni e não apresentam citotoxicidade in vitro em células animais (macrófagos e fibroblastos) (VOLCÃO et al., 2019). Segundo Volcão et al. (2019) o extrato de L. deliciosus na concentração máxima testada também apresentou atividade antibacteriana para Klebsiella pneumoniae KPC, Staphylococcus aureus e Salmonella Typhimurium. A atividade antioxidante está relacionada à presença de compostos bioativos, principalmente compostos fenólicos, como flavonóides e carotenóides (AGRODOK, 2006; CHOI et al., 2018; VAMANU et al. 2018; VOLCÃO et al., 2019). Do mesmo modo, a atividade antibacteriana está relacionada com a presença de compostos fenólicos de extratos aquosos (PEREIRA et al. 2006, 2007). O extrato aquoso de A. auricula é relatado com o maior teor de compostos fenólicos, apresentando CIM = 625 μg / mL, além de atividade bactericida contra A. baumanni (VOLCÃO et al., 2019).
Nesse sentido, o conhecimento sobre as propriedades derivadas de basidiomicetos devem ser cada vez mais desenvolvidas, pois são importantes para a descoberta de novas substâncias com funções antimicrobianas, antifúngicas, antiparasitárias e antivirais (SHIAO et al., 1994, AGRODOK, 2006; CHEUNG, 2008; WU, 2015; PETRE, 2015; KIM et al., 2017; OLIVEIRA, 2019). O presente estudo pretende investigar o potencial de diferentes extratos das espécies Auricularia auricula, Lactarius deliciosus e Laccaria laccata sobre o oomiceto patogênico P. insidiosum.

Metodologia

- Áreas de coleta e ecologia das espécies de macrofungos: as três espécies de cogumelos silvestres L. deliciosus, L. laccata e A. auricula serão coletadas em três áreas, duas localizadas no Campus Capão do Leão, Universidade Federal de Pelotas – UFPel/RS; e uma área localizada em Pelotas/RS no Bairro Vila Assumpção (31°45'52.63"S 52°15'35.35"O). A primeira área vegetativa compreende um bosque de coníferas e árvores de pequeno porte, com predominância de espécies de Pinus spp. e solo coberto por serapilheira de acículas, fornecendo substrato e hábitat ideal para espécies de macrofungos principalmente basidiomicetos ectomicorrízicos, que se desenvolvem quando as condições climáticas essenciais, como temperatura e umidade são propícias (PUTZKE, 2015; TIM, 2018). Nesse caso, se desenvolvem as espécies L. deliciosus e L. laccata nas estações de frio e umidade, como outono e inverno principalmente (PUTZKE, 2015; TIM, 2018), mas pode ocorrer também na primavera. Essa área está localizada em frente à Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel (31°48'8.69"S 52°24'51.83"O). A segunda área de coleta será no Horto Botânico Irmão Teodoro Luís (31º48'57''S 52º25'57''O) (Fig.2), que caracteriza-se por tipos fisionômicos de vegetação de restinga, incluindo mata de restinga arenosa e mata de restinga turfosa (PRADO, 2018). O Horto apresenta um ecossistema florestal com diferentes grupos taxonômicos de macrofungos associados. Uma delas é a espécie A. auricula, que tem como hábitat madeiras vivas ou mortas e por isso é considerada xilófila (TIM, 2018). Geralmente se encontra anualmente os basidiomas em galhos e troncos deteriorados, o que indica que pode aparecer durante várias estações do ano, alternando em períodos férteis e estéreis (TIM, 2018). Tem como hábito condições de alta umidade, podendo produzir aglomerados imbricados e basidiomas muito grandes (FRANCK, 2019). Além disso, A. auricula é também considerada uma espécie higroscópica, pois seu basidioma pode desidratar em períodos de estiagem e retornar a forma normal nos períodos de maior umidade (TIM, 2018). Sua distribuição compreende regiões tropicais à temperadas, geralmente sobre bosques sombreados (MUSNGI et al., 2005; WU et al., 2015; FRANCK, 2019). A área localizada no bairro Vila Assumpção encontra-se nas extensões de vegetação de Pinus spp. da região (31º45'52''S 52º15'32''W e 31º45'53"S 52º15'37''W), caracterizada por acumular serapilheira de acículas, onde espécies de basidiomicetos especialmente ectomicorrízicos se desenvolvem, como L. deliciosus e L. laccata, nas mesmas condições descritas na primeira área.
- Coleta, identificação e preparo: as duas coleções (conjunto de espécimes) de macrofungos serão coletadas no ambiente das áreas descritas durante os meses de estações outono, inverno e primavera, entre os meses de maio até novembro, devido ao clima propício para o desenvolvimento das espécies. Após a coleta, as espécies serão identificadas de acordo com características macro e micro morfológicas e separadas em amostras representativas. Depois serão transferidas para estufa a 50ºC por um período de 96 horas para desidratação dos basidiocarpos e posterior armazenamento em recipientes hermeticamente fechados, protegidos da luz e umidade até a produção dos extratos (VOLCÃO et. al., 2019). Uma parcela representativa de cogumelos coletados será armazenada e mantida congelada até a produção dos extratos.
- Extração e ensaios in vitro: a preparação dos extratos das espécies de A. auricula, L. deliciosus e L. laccata assim como os ensaios in vitro com P. insidiosum serão conduzidos no laboratório de Micologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal de Pelotas.
- Obtenção dos extratos aquosos, etanólicos e hidro-alcoólicos: após a desidratação em estufa e congelamento dos cogumelos silvestres A. auricula, L. deliciosus e L. laccata os mesmos serão triturados por maceração e utilizados para produção e obtenção dos extratos aquosos, etanólicos e hidro-alcoólicos. Na produção de extratos aquosos (EAQ), o pó triturado dos cogumelos será diluído em água destilada (AD), na concentração de 25g de pó para 100 mL de AD. Na preparação dos extratos hidro-álcoolicos (EHA), o material em pó (25 gr) será adicionado a 100 ml de etanol 50%. Já para os extratos acoólicos (EAL), o pó dos cogumelos (25 gr) será adicionado a 100 mL de uma solução de etanol 95%, (ROESLER et al., 2007). Em seguida as soluções serão incubadas em banho de ultrassom (SB-5200 DTDN Ultrasonic Cleaner) a uma temperatura de 40ºC por 120 minutos para a extração (ROESLER et al., 2007). As suspensões serão filtradas a vácuo, em papel filtro Whatman ® nº1, e depois armazenadas em geladeira a 4ºC sob ausência de luz até o momento dos testes de suscetibilidade.
- Isolados de Pythium insidiosum: Serão avaliados 20 isolados de P. insidiosum, sendo 12 oriundos de pitiose em equinos, 5 cepas padrão (CBS) oriundas de humanos, 2 isolados provenientes da doença em caninos e 01 amostra de P. insidiosum isolado de ambiente aquático do RS. Os isolados clínicos, incluindo o isolado ambiental, foram identificados por suas características macro e micromorfológicas e confirmadas molecularmente conforme descrito por Azevedo et al. (2012) e pertencem ao laboratório de Micologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFPEL.
- Preparação do inóculo: os testes de suscetibilidade serão realizados utilizando duas preparações diferentes de inóculo: A) Inóculo de zoósporos: este inóculo será preparado empregando o método de zoosporogênese na qual cada suspensão de inóculo de zoósporo terá 20.000 a 30.000 zoósporos/mL de P.insidiosum, descrito e padronizado por Pereira et. al. (2008). B) Inóculo de micélio: Já na cultura de inóculo micelial (hifas) serão preparados a partir de suspensões de micélio de P. insidiosum que serão obtidas através do cultivo do microrganismo em ágar de levedura, constituído de ágar (20g/1000ML; Merck) e extrato de levedura (1g/1000ML; Difco) com incubação por 96 horas a 37ºC. As culturas serão cobertas com 10mL de água destilada estéril e o micélio será raspado com uma lâmina de bisturi estéril. Depois essa solução será transferida para um tubo de ensaio, então a densidade óptica será determinada utilizando um espectrofotômetro e o inóculo será ajustado para uma transmitância de 80 a 85% a 530 nm. Para testar a viabilidade dessa suspensão, uma alíquota de 100 mL será adicionado a 900 mL de caldo Sabouraud e incubada a 37ºC por 48 horas. A homogeneidade da suspensão será avaliada por microscopia. Em seguida, 10 mL da suspensão serão colocadas em uma lâmina de vidro para microscópio e após coberto por uma lamínula para análise em microscopia (objetiva 20 x) (FONSECA et al., 2014).
- Suscetibilidade in vitro: os testes de suscetibilidade serão realizados de acordo com o protocolo de microdiluição em caldo (M38-A2) do CLSI (2008) com adaptações para oomiceto (FONSECA et al., 2015). Para a realização dos testes, os extratos serão diluídos em RPMI 1640 glicosado e tamponado a pH 7,0 com 0,165M MOPS, em concentrações variando de 2500-625 μg/mL. Alíquotas de 100μL dessas diluições serão dispensadas sequencialmente nas microplacas, preenchendo os poços pertencentes às colunas numeradas de um a dez. A estas colunas será distribuído um volume de 100μL do inóculo. Para cada teste serão utilizadas colunas controle positivo (100 µL de RPMI e 100 µL de inóculo) e negativo (100 µL de RPMI e 100 µL de diluição do extrato). Todos os testes serão realizados em triplicata. As placas serão incubadas sob agitação de 40 RPM a 37°C por 48 horas. A leitura será visual e levará em consideração o crescimento ou não de hifas. A menor concentração dos extratos capaz de inibir o crescimento de P. insidiosum será identificada como concentração inibitória mínima (CIM). As concentrações capazes de inibir 50% e 90% dos isolados serão denominadas de CIM 50 e CIM 90, respectivamente. As concentrações acima da CIM serão utilizadas para a determinação da concentração oomicida mínima (COM). Para isso 100 μL da diluição serão transferidos para tubos contendo 900 μL de caldo Sabouraud, e ficarão incubados a 37°C por 48 horas. A menor concentração do extrato que não evidenciará crescimento será considerada a COM.


Indicadores, Metas e Resultados

O presente trabalho é o primeiro estudo a avaliar a ação antimicrobiana de extratos de macrofungos sobre P. insidiosum. Espera-se que os diferentes extratos elaborados a partir de macrofungos silvestres apresentem excelente atividade anti- P. insidiosum, visando novas perspectivas de compostos antimicrobianos para o controle do mesmo, além de novas perspectivas terapêuticas da enfermidade.
As descobertas a respeito das possíveis espécies de macrofungos que tenham compostos bioativos com potencial antagonista ao oomiceto contribuem também para que sejam feitas maiores investigações sobre as potencialidades de macrofungos.
Com a proposta de projeto espera-se participar de atualizações sobre estudos na área de compostos naturais, sobre a atuação e importância de cogumelos silvestres da região e de atualizações sobre o oomiceto estudado. Além disso, propõe divulgar os resultados através de artigos em revistas indexadas da área de estudo e eventos, como congressos e simpósios.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CAROLINA DOS SANTOS BERMANN
CAROLINA LITCHINA BRASIL
CAROLINE QUINTANA BRAGA
DANIELA ISABEL BRAYER PEREIRA1
DIULIANI FONSECA MORALES
EDUARDO BERNARDI1
LISIANE MARTINS VOLCÃO
LUÍZE GARCIA DE MELO
Sônia de Avila Botton

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