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Pythium sp. é um oomiceto, classificado taxonomicamente na Família Pythiaceae, Ordem Pythiales, Classe Oomycetes e Reino Straminipila (SANTURIO et al., 2006; KIRK et al., 2008). O gênero apresenta organismos de reprodução assexuada, caracterizada pela produção de zoósporos biflagelados (SANTURIO et al., 2004). As espécies sapróbias podem crescer no solo, locais alagados e na matéria orgânica em decomposição, ou podem ser parasitas de animais e plantas (BHALERAO et al., 2020; RAI et al.; 2020; VALENTE, 2020).
O desenvolvimento de Pythium sp. depende de fatores abióticos no ecossistema ao qual faz parte (SANTURIO et al., 2006), como áreas alagadas e temperatura (ZAMBRANO et al., 2017; ZARO et al., 2018). O oomiceto cresce otimamente a 28ºC e mais lentamente a 32ºC e 37ºC (KRAJAEJUN et al., 2010). Zambrano et al. (2017) evidenciou in vitro que Pythium insidiosum tem viabilidade entre temperaturas de 5ºC e 15ºC, porém em temperaturas mais altas entre 20ºC e 37ºC o processo de zoosporogênese é induzido liberando os zoósporos. A espécie P. insidiosum é o agente etiológico causador da pitiose, uma doença emergente que atinge predominantemente o tecido subcutâneo de mamíferos em regiões tropicais, subtropicais e temperadas (LEAL et al., 2001; SANTURIO et al., 2006; GAASTRA et al., 2010; KRAJAEJUN et al., 2018; RAI et al., 2020).
Já foram relatadas afecções em equinos, canídeos, felinos, bovinos, caprinos, animais silvestres e humanos (LEAL et al., 2001; SANTURIO et al., 2006; KRAJAEJUN et. al., 2018; ZARO et al., 2018; DOWST et al., 2019; PERMPALUNG et al., 2019; RAI et al., 2020). No entanto, convém ressaltar que a espécie equina é a mais atingida, principalmente no Brasil, considerado área endêmica da doença e com o maior número de casos relatados para a espécie (LEAL et al., 2001; SANTURIO et al., 2006; MARCOLONGO-PEREIRA et al., 2012; ZARO et al., 2018; ROSSATO et al., 2018; RAI et al.; 2020). A pitiose equina é descrita em diversos países da América Latina, com potencial para circular em grandes áreas no Uruguai e Rio Grande do Sul, Brasil (MACHADO et al., 2018; ROMERO, et al., 2019). Apesar disso, nas últimas décadas, a pitiose tem sido objeto de estudo para todos os mamíferos que possivelmente entram em contato com o agente em ambientes alagados (SANTURIO et al., 2006; ZARO et al., 2018).
A pitiose está associada ao nicho ecológico de P. insidiosum, principalmente áreas alagadas, reservatórios de água, água de irrigação e solo, que são reservatórios naturais do oomiceto (SUPABANDHU, 2008; VANITTANAKOM, 2014). Condições como estações chuvosas também são determinantes para ocorrência de pitiose em algumas regiões (MARCOLONGO-PEREIRA et al., 2012). Em áreas agrícolas endêmicas da Tailândia esses ambientes podem ser uma importante fonte de infecção por P. insidiosum para trabalhadores rurais (SUPABANDHU, 2008; VANITTANAKOM, 2014). Existem indicações de que o nicho ambiental de P. insidiosum está em expansão, pois já foi relatado em clima árido ou semiárido, e pode estar relacionado com as alterações ambientais, como inundações de campos de arroz ou desenvolvimento irrigado da paisagem (GAASTRA et al., 2010). Outro fator muito preocupante é a adaptação de P. insidiosum a climas mais temperados, onde Mendoza (2009) sugere que a expansão de seu nicho ecológico está relacionado com a intensificação do aquecimento global.
Já se sabe que o aumento de exsudatos no solo, principalmente pela adubação das plantas com excesso de nitrogênio ou aplicações de agroquímicos, atuam de forma a estimular a germinação de microrganismos patogênicos, incluindo Pythium sp. (TOKESHI, 2000). Os agrotóxicos e insumos químicos também têm gerado diversos impactos ecológicos e ambientais (TOKESHI, 2000; SPADOTTO et al., 2004; CARNEIRO et al., 2015), especialmente quando a resposta evolutiva de bactérias, fungos e parasitas à pressão seletiva exercida sobre eles, estabelece resistência aos agrotóxicos, como fungicidas (SPADOTTO et al., 2004; CARNEIRO et al., 2015). Constata-se também que existe essa mesma relação de resistência dos fungos e bactérias aos antibióticos (SHELDON JR, 2003).
As terapias disponíveis para o tratamento da pitiose em animais e humanos, incluindo a cirurgia, imunoterapia, nanopartículas de prata e agentes antimicrobianos (KRAJAEJUM et al., 2006; FONSECA, 2015, LORETO et al. 2019; VALENTE et al., 2019; IANISKI et al., 2020) demonstram respostas bastante variáveis, com relatos de sucessos e insucessos terapêuticos (GAASTRA et al., 2010). P. insidiosum não responde bem aos antifúngicos convencionais, assim como os azólicos e a anfortericina B. Esse fato está associado à falta de ergosterol na membrana citoplasmática e o que diferencia esse oomiceto de fungos verdadeiros (MENDOZA & NEWTON, 2005; SANTURIO et al., 2006; GAASTRA, 2010; MENDOZA; VILELA, 2013; ARAÚJO et al., 2016; PERMPALUNG et al., 2019).
Portanto, o interesse por substâncias naturais com atividade biológica e potencial antagônico aos micro-organismos patogênicos têm atraído estudos que buscam descobrir novos compostos com alta eficácia e baixa toxicidade (SHIAO et al., 1994; SHELDON JR, 2003; ARAÚJO et al., 2016; VOLCÃO et al., 2019). Os macrofungos pertencentes ao filo Basidiomycota são conhecidos por suas estruturas de reprodução que formam basidiomas (PUTZKE, 2015). Esses organismos participam de funções ecológicas e biológicas fundamentais nos ciclos biogeoquímicos e cadeias tróficas (ANTUNES & KOYAMA, 2017; INNOCENTI & SABATINI, 2018; TIMM, 2018), além de também atuar no controle populacional de espécies do ambiente como antagonistas naturais e atrair ou repelir organismos do solo (BALDIN et al., 2011; DEGENKOLB & VILCINSKAS, 2016; GONZÁLEZ et al., 2017; INNOCENTI & SABATINI, 2018).
Os macrofungos silvestres possuem propriedades biológicas ativas com potencialidades para o desenvolvimento de novas categorias de compostos para o controle de organismos patogênicos (PETRE, 2015; VOLCÃO et al., 2019). Dentre estes, é importante destacar as espécies de basidiomicetos Auricularia auricula, Lactarius deliciosus e Laccaria laccata que apresentam atividades antioxidantes, assim como demonstram possuir propriedades antimicrobianas contra Acinetobacter baumanni e não apresentam citotoxicidade in vitro em células animais (macrófagos e fibroblastos) (VOLCÃO et al., 2019). Segundo Volcão et al. (2019) o extrato de L. deliciosus na concentração máxima testada também apresentou atividade antibacteriana para Klebsiella pneumoniae KPC, Staphylococcus aureus e Salmonella Typhimurium. A atividade antioxidante está relacionada à presença de compostos bioativos, principalmente compostos fenólicos, como flavonóides e carotenóides (AGRODOK, 2006; CHOI et al., 2018; VAMANU et al. 2018; VOLCÃO et al., 2019). Do mesmo modo, a atividade antibacteriana está relacionada com a presença de compostos fenólicos de extratos aquosos (PEREIRA et al. 2006, 2007). O extrato aquoso de A. auricula é relatado com o maior teor de compostos fenólicos, apresentando CIM = 625 μg / mL, além de atividade bactericida contra A. baumanni (VOLCÃO et al., 2019).
Nesse sentido, o conhecimento sobre as propriedades derivadas de basidiomicetos devem ser cada vez mais desenvolvidas, pois são importantes para a descoberta de novas substâncias com funções antimicrobianas, antifúngicas, antiparasitárias e antivirais (SHIAO et al., 1994, AGRODOK, 2006; CHEUNG, 2008; WU, 2015; PETRE, 2015; KIM et al., 2017; OLIVEIRA, 2019). O presente estudo pretende investigar o potencial de diferentes extratos das espécies Auricularia auricula, Lactarius deliciosus e Laccaria laccata sobre o oomiceto patogênico P. insidiosum.

- Áreas de coleta e ecologia das espécies de macrofungos: as três espécies de cogumelos silvestres L. deliciosus, L. laccata e A. auricula serão coletadas em três áreas, duas localizadas no Campus Capão do Leão, Universidade Federal de Pelotas – UFPel/RS; e uma área localizada em Pelotas/RS no Bairro Vila Assumpção (31°45'52.63"S 52°15'35.35"O). A primeira área vegetativa compreende um bosque de coníferas e árvores de pequeno porte, com predominância de espécies de Pinus spp. e solo coberto por serapilheira de acículas, fornecendo substrato e hábitat ideal para espécies de macrofungos principalmente basidiomicetos ectomicorrízicos, que se desenvolvem quando as condições climáticas essenciais, como temperatura e umidade são propícias (PUTZKE, 2015; TIM, 2018). Nesse caso, se desenvolvem as espécies L. deliciosus e L. laccata nas estações de frio e umidade, como outono e inverno principalmente (PUTZKE, 2015; TIM, 2018), mas pode ocorrer também na primavera. Essa área está localizada em frente à Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel (31°48'8.69"S 52°24'51.83"O). A segunda área de coleta será no Horto Botânico Irmão Teodoro Luís (31º48'57''S 52º25'57''O) (Fig.2), que caracteriza-se por tipos fisionômicos de vegetação de restinga, incluindo mata de restinga arenosa e mata de restinga turfosa (PRADO, 2018). O Horto apresenta um ecossistema florestal com diferentes grupos taxonômicos de macrofungos associados. Uma delas é a espécie A. auricula, que tem como hábitat madeiras vivas ou mortas e por isso é considerada xilófila (TIM, 2018). Geralmente se encontra anualmente os basidiomas em galhos e troncos deteriorados, o que indica que pode aparecer durante várias estações do ano, alternando em períodos férteis e estéreis (TIM, 2018). Tem como hábito condições de alta umidade, podendo produzir aglomerados imbricados e basidiomas muito grandes (FRANCK, 2019). Além disso, A. auricula é também considerada uma espécie higroscópica, pois seu basidioma pode desidratar em períodos de estiagem e retornar a forma normal nos períodos de maior umidade (TIM, 2018). Sua distribuição compreende regiões tropicais à temperadas, geralmente sobre bosques sombreados (MUSNGI et al., 2005; WU et al., 2015; FRANCK, 2019). A área localizada no bairro Vila Assumpção encontra-se nas extensões de vegetação de Pinus spp. da região (31º45'52''S 52º15'32''W e 31º45'53"S 52º15'37''W), caracterizada por acumular serapilheira de acículas, onde espécies de basidiomicetos especialmente ectomicorrízicos se desenvolvem, como L. deliciosus e L. laccata, nas mesmas condições descritas na primeira área.
- Coleta, identificação e preparo: as duas coleções (conjunto de espécimes) de macrofungos serão coletadas no ambiente das áreas descritas durante os meses de estações outono, inverno e primavera, entre os meses de maio até novembro, devido ao clima propício para o desenvolvimento das espécies. Após a coleta, as espécies serão identificadas de acordo com características macro e micro morfológicas e separadas em amostras representativas. Depois serão transferidas para estufa a 50ºC por um período de 96 horas para desidratação dos basidiocarpos e posterior armazenamento em recipientes hermeticamente fechados, protegidos da luz e umidade até a produção dos extratos (VOLCÃO et. al., 2019). Uma parcela representativa de cogumelos coletados será armazenada e mantida congelada até a produção dos extratos.
- Extração e ensaios in vitro: a preparação dos extratos das espécies de A. auricula, L. deliciosus e L. laccata assim como os ensaios in vitro com P. insidiosum serão conduzidos no laboratório de Micologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal de Pelotas.
- Obtenção dos extratos aquosos, etanólicos e hidro-alcoólicos: após a desidratação em estufa e congelamento dos cogumelos silvestres A. auricula, L. deliciosus e L. laccata os mesmos serão triturados por maceração e utilizados para produção e obtenção dos extratos aquosos, etanólicos e hidro-alcoólicos. Na produção de extratos aquosos (EAQ), o pó triturado dos cogumelos será diluído em água destilada (AD), na concentração de 25g de pó para 100 mL de AD. Na preparação dos extratos hidro-álcoolicos (EHA), o material em pó (25 gr) será adicionado a 100 ml de etanol 50%. Já para os extratos acoólicos (EAL), o pó dos cogumelos (25 gr) será adicionado a 100 mL de uma solução de etanol 95%, (ROESLER et al., 2007). Em seguida as soluções serão incubadas em banho de ultrassom (SB-5200 DTDN Ultrasonic Cleaner) a uma temperatura de 40ºC por 120 minutos para a extração (ROESLER et al., 2007). As suspensões serão filtradas a vácuo, em papel filtro Whatman ® nº1, e depois armazenadas em geladeira a 4ºC sob ausência de luz até o momento dos testes de suscetibilidade.
- Isolados de Pythium insidiosum: Serão avaliados 20 isolados de P. insidiosum, sendo 12 oriundos de pitiose em equinos, 5 cepas padrão (CBS) oriundas de humanos, 2 isolados provenientes da doença em caninos e 01 amostra de P. insidiosum isolado de ambiente aquático do RS. Os isolados clínicos, incluindo o isolado ambiental, foram identificados por suas características macro e micromorfológicas e confirmadas molecularmente conforme descrito por Azevedo et al. (2012) e pertencem ao laboratório de Micologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFPEL.
- Preparação do inóculo: os testes de suscetibilidade serão realizados utilizando duas preparações diferentes de inóculo: A) Inóculo de zoósporos: este inóculo será preparado empregando o método de zoosporogênese na qual cada suspensão de inóculo de zoósporo terá 20.000 a 30.000 zoósporos/mL de P.insidiosum, descrito e padronizado por Pereira et. al. (2008). B) Inóculo de micélio: Já na cultura de inóculo micelial (hifas) serão preparados a partir de suspensões de micélio de P. insidiosum que serão obtidas através do cultivo do microrganismo em ágar de levedura, constituído de ágar (20g/1000ML; Merck) e extrato de levedura (1g/1000ML; Difco) com incubação por 96 horas a 37ºC. As culturas serão cobertas com 10mL de água destilada estéril e o micélio será raspado com uma lâmina de bisturi estéril. Depois essa solução será transferida para um tubo de ensaio, então a densidade óptica será determinada utilizando um espectrofotômetro e o inóculo será ajustado para uma transmitância de 80 a 85% a 530 nm. Para testar a viabilidade dessa suspensão, uma alíquota de 100 mL será adicionado a 900 mL de caldo Sabouraud e incubada a 37ºC por 48 horas. A homogeneidade da suspensão será avaliada por microscopia. Em seguida, 10 mL da suspensão serão colocadas em uma lâmina de vidro para microscópio e após coberto por uma lamínula para análise em microscopia (objetiva 20 x) (FONSECA et al., 2014).
- Suscetibilidade in vitro: os testes de suscetibilidade serão realizados de acordo com o protocolo de microdiluição em caldo (M38-A2) do CLSI (2008) com adaptações para oomiceto (FONSECA et al., 2015). Para a realização dos testes, os extratos serão diluídos em RPMI 1640 glicosado e tamponado a pH 7,0 com 0,165M MOPS, em concentrações variando de 2500-625 μg/mL. Alíquotas de 100μL dessas diluições serão dispensadas sequencialmente nas microplacas, preenchendo os poços pertencentes às colunas numeradas de um a dez. A estas colunas será distribuído um volume de 100μL do inóculo. Para cada teste serão utilizadas colunas controle positivo (100 µL de RPMI e 100 µL de inóculo) e negativo (100 µL de RPMI e 100 µL de diluição do extrato). Todos os testes serão realizados em triplicata. As placas serão incubadas sob agitação de 40 RPM a 37°C por 48 horas. A leitura será visual e levará em consideração o crescimento ou não de hifas. A menor concentração dos extratos capaz de inibir o crescimento de P. insidiosum será identificada como concentração inibitória mínima (CIM). As concentrações capazes de inibir 50% e 90% dos isolados serão denominadas de CIM 50 e CIM 90, respectivamente. As concentrações acima da CIM serão utilizadas para a determinação da concentração oomicida mínima (COM). Para isso 100 μL da diluição serão transferidos para tubos contendo 900 μL de caldo Sabouraud, e ficarão incubados a 37°C por 48 horas. A menor concentração do extrato que não evidenciará crescimento será considerada a COM.

O presente trabalho é o primeiro estudo a avaliar a ação antimicrobiana de extratos de macrofungos sobre P. insidiosum. Espera-se que os diferentes extratos elaborados a partir de macrofungos silvestres apresentem excelente atividade anti- P. insidiosum, visando novas perspectivas de compostos antimicrobianos para o controle do mesmo, além de novas perspectivas terapêuticas da enfermidade.
As descobertas a respeito das possíveis espécies de macrofungos que tenham compostos bioativos com potencial antagonista ao oomiceto contribuem também para que sejam feitas maiores investigações sobre as potencialidades de macrofungos.
Com a proposta de projeto espera-se participar de atualizações sobre estudos na área de compostos naturais, sobre a atuação e importância de cogumelos silvestres da região e de atualizações sobre o oomiceto estudado. Além disso, propõe divulgar os resultados através de artigos em revistas indexadas da área de estudo e eventos, como congressos e simpósios.