Portal InstitucionalUFPEL

As superfícies mucosas são extensas áreas do organismo, vulneráveis a infecções causadas por microrganismos patogênicos e que, muitas vezes, estão diretamente envolvidas na colonização microbiana inicial ou mesmo constituem forma de transmissão de vários agentes infecciosos. Por outro lado, estas áreas propiciam a primeira linha de defesa contra microrganismos infecciosos que as utilizam como local de entrada no organismo. Desse modo, a estimulação do sistema imune de mucosa, através do uso de vacinas, por exemplo, é primordial no combate às infecções.
As vias de inoculação mais utilizadas para a administração de vacinas são as intramusculares e as subcutâneas. No entanto, a resposta imune de mucosa é induzida de forma mais eficiente quando a vacina é administrada na própria superfície mucosa, por via oral, nasal, retal ou vaginal, uma vez que as vacinas de uso parenteral geralmente induzem uma resposta fraca em nível de mucosa e, deste modo, são menos eficientes contra infecções nestes locais.
As superfícies mucosas têm grande importância na patogenia das enfermidades causadas pelos alphaherpesvírus bovinos tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5), responsáveis por abundantes prejuízos econômicos na bovinocultura mundial. Enquanto que o BoHV-1 está relacionado com a ocorrência de doenças respiratórias (Rinotraqueíte Infecciosa Bovina - IBR) e reprodutivas (vulvovaginite ou balanopostite – IPV/IBD e abortos), o BoHV-5 é o agente etiológico da meningoencefalite herpética, uma grave e importante enfermidade de bovinos, com numerosos surtos notificados anualmente. A infecção e a disseminação dos alphaherpesvírus bovinos normalmente ocorrem através das cavidades revestidas por células epiteliais de mucosa, como a cavidade nasal, orofaringe, conjuntiva e trato genital. O controle destes vírus tem sido realizado através da utilização de vacinas vivas atenuadas, inativadas e ainda vacinas recombinantes para ambas as cepas virais. No entanto, nenhuma vacina contra o BoHV-5 ou BoHV-1, de aplicação na mucosa, tem sido descrita pela literatura científica. Além disso, as vacinas vivas podem criar a figura de portadores e, muitas vezes, estão relacionadas a uma série de problemas reprodutivos, como o aborto. As vacinas inativadas, por outro lado, são seguras e não revertem à forma virulenta. Entretanto, requerem a utilização de várias doses e a inclusão de substâncias adjuvantes ou imunoestimulantes para potencialização da resposta imune.
As superfícies mucosas também são muito importantes na epidemiologia da diarreia viral bovina, uma doença causada por um vírus RNA, da família Flaviviridae, gênero Pestivirus. A infecção pelo vírus da diarreia viral bovina (VDVB) pode resultar em uma grande variabilidade de sinais clínicos como aborto e retorno ao cio, presença de eritemas, erosões no aparelho digestivo (doença das mucosas) e trombocitopenia. Quando a infecção ocorre em fêmeas prenhes, antes do feto se tornar imunocompetente, existe o risco de nascimento de terneiros imunotolerantes ao vírus e que permanecem persistentemente infectados por toda a vida. Estes animais são responsáveis pela eliminação permanente de BVDV para o ambiente contaminando outros animais. O controle desta enfermidade tem se dado pelo uso de vacinas inativadas e vivas atenuadas, de aplicação parenteral, que resultam em fraca resposta nas mucosas.
Considerando-se a importância das vias mucosas nasal e vaginal na epidemiologia dos alphaherpesvírus e dos pestivirus bovinos, principalmente na sua transmissão, torna-se evidenciado o interesse no desenvolvimento de vacinas que propiciem imunidade de mucosa contra estes agentes infecciosos. A finalidade deste estudo é avaliar a imunogenicidade de vacinas contra estes agentes etiológicos, aplicadas nas mucosas nasal e/ou vaginal, utilizando diferentes adjuvantes, o que pode representar uma estratégia promissora no controle das enfermidades causadas por este vírus, mimetizando a infecção natural.

1. Instalações
As atividades laboratoriais deste estudo serão realizadas junto ao Laboratório de Virologia e Imunologia, da Faculdade de Veterinária, da Universidade Federal de Pelotas. Os ensaios in vivo de aplicação das vacinas serão realizados junto a Fazenda Agropecuária Yvyporã, na cidade de Pedro Osório - RS.

2. Formulações do sistema de entrega de antígeno
Serão formulados géis termossensíveis de poloxamers de acordo com o “método frio”, descrito por Schmolka (IRVING, 1972). Serão avaliadas diferentes formulações para posterior utilização in vivo.

2.1 Ensaio da Erosão/Dissolução
O perfil de dissolução do gel será determinado por gravimetria, em que em um frasco de vidro de 13mm de diâmetro, pesado previamente, contendo um volume conhecido do gel, que é equilibrado a 37°C, recebe uma solução tampão de fosfato pH 7,4 na condição de não saturação do meio (Sink
condition). Em intervalos pré-definidos, o meio de liberação será removido, o frasco é pesado e o peso do gel erodido/dissolvido é calculado pela diferença de peso do frasco (ZHANG et al., 2002).

2.2. Ensaio de liberação in vitro do antígeno
As amostras de vacina serão colocadas de maneira individual em tubos de ensaio contendo meio de liberação (PBS pH 7,2 ou fluido vaginal simulado – FVS, pH 7,35) e a quantidade do antígeno vacinal liberado para o meio é então mensurada por ELISA quantitativo e plotada como percentual cumulativo de liberação. O antígeno vacinal liberado nos meios PBS (pH 7,2) ou fluído
vaginal simulado (FVS, pH 7,35) representará o perfil de liberação/administração da vacina que deverá ocorrer a partir do protótipo colocado dentro do ambiente vaginal. As avaliações de cada formulação serão feitas em quintuplicata (LAIRD et al., 2013).

2.3. Ensaio de estabilidade da vacina
As propriedades reológicas e de viscosidade das formulações poliméricas (solução polimérica e/ou gel) serão determinadas com auxílio de um reômetro de Brookfield ou algum outro viscosímetro com as mesmas características (LAIRD et al., 2013).

3. Preparação das vacinas experimentais
3.1 Células e Vírus
Cepas de BoHV-1 (cepa VV - Laboratório de Virologia e Imunologia UFPel), BoHV-5 (cepa RP – Laboratório de Virologia e Imunologia – UFPel) e BVDV (padrão singer) serão amplificadas e tituladas em células Madin-Darby Bovine Kidney – MDBK. Será utilizado um título viral de 107 DICC50/mL, tanto para a confecção das vacinas experimentais como para purificação visando
análises moleculares. Após o cultivo dos vírus, as suspensões virais serão inativadas com bromoetilamina - BEI (C2H7Br2N, - Merck), na concentração final de 0,02 M e pH 7,5.

3.2 Adjuvantes
Serão avaliados, quanto à sua capacidade adjuvante, o microrganismo Bacillus toyonensis e a Interleucina 17 (IL-17), fornecidos pelo Laboratório de Microbiologia, do Centro de Desenvolvimento Tecnológico, da Universidade Federal de Pelotas (UFPel); hidróxido de alumínio (Croda – Health Care) e extrato hidroalcóolico de própolis, produzida segundo metodologia conhecida (FISCHER et al., 2010).
.
4. Ensaio in vivo de estabilidade da vacina
4.1. Inoculação dos bovinos
Para avaliação das vacinas de aplicação nas mucosas nasal e vaginal, serão eleitos dois polímeros que apresentarão melhores resultados in vitro e estes serão avaliados in vivo em experimentos e tempos distintos (Experimento 1 e Experimento 2). Os animais utilizados serão novilhas de corte, com 3 a 24 meses de idade da raça Brangus, mantidos em condições normais de pastejo em campo nativo. No total serão avaliadas 140 novilhas homogêneas, previamente selecionadas conforme raça, idade, peso, ECC, soronegativas frente ao BoHV e BVDV. Os animais serão divididos em dois distintos experimentos, cada um com 70 vacas. Serão divididas em sete grupos de 10 animais no Experimento 1 e também Experimento 2. Em cada experimento distinto será avaliada uma formulação de gel (um polímero)
como sistema de entrega do antígeno vacinal. Em ambos experimentos os animais serão submetidos aos seguintes tratamentos (2 doses vacinais, com intervalo de 21 dias): G1 (Antígeno bacteriano):
10 animais receberão 5 mL de vacina composta por 2,5 mL de antígeno, 2,5 mL do polímero
associado a 109 de Bacillus toyonensis, via intravaginal; G2 (Antígeno IL-17): 10 animais receberão
2,5 mL de antígeno associado a 2,5 mL do polímero e 10µg de Interleucina 17 (IL-17), via
intravaginal; G3 (Antígeno Polímero): 10 animais receberão 2,5 mL do antígeno e 2,5 mL do
polímero; G4 (Comercial): 10 animais receberão 5 mL de vacina comercial com Hidróxido de
Alumínio (I.M.) (Controle positivo); G5 (Adjuvante bacteriano e Polímero): 10 animais receberão
2,5 mL do polímero, 2,5 mL de PBS e 109 de Bacillus toyonensis, via intravaginal (Controle negativo);
G6 (G6 Adjuvante IL-17 e Polímero): 10 animais receberão 2,5 mL polímero, 2,5 mL de PBS e 10µg
da IL-17, pela via intravaginal, (Controle negativo); G7 (Polímero 1): 10 animais receberão 2,5 mL do
polímero e 2,5 mL de PBS, pela via intravaginal (Controle negativo).

4.3. Avaliação da resposta humoral
4.3.1. Coleta de material
A coleta de material será realizada nos dias 0 e 21, 42 e 63 após a primeira vacinação. Serão coletadas amostras de sangue, secreção nasal e vaginal para avaliação da resposta imunes conferida pelas vacinas. As amostras de sangue serão coletadas sem anticoagulante e com citrato de sódio 0,38% (v.v.). O sangue coletado com anticoagulante terá como finalidade a obtenção de leucócitos (FISCHER et al., 2005). Amostras de secreção nasal e secreção vaginal serão coletadas individualmente para mensuração da resposta humoral, através de suabes de uso humano e através do coletor Metrichech® (MSD Animal), respectivamente.

4.3.2 ELISA Indireto e soroneutralização
As amostras de soro sanguíneo, secreção nasal e vaginal serão submetidas ao teste de ELISA indireto a fim de detectar-se anticorpos IgA e IgG contra BoHV-1, BoHV-5 e BVDV. Para detecção do título de anticorpos totais nas mesmas secreções e no sangue, será utilizada a técnica de soroneutralização (FISCHER et al., 2007).

4.4 Avaliação da resposta celular
4.4.1. Real time RT-PCR
Os níveis de expressão de mRNA de citocinas envolvidas com a imunidade humoral (IL-2, IL-13 e IL-17) e celular (IFN-gamma) serão avaliados através da técnica de Real Time RT-PCR (qRTPCR). Para tal, cDNA será sintetizado a partir de 200 ng de RNA, utilizando High Capacity cDNA
Reverse Transcription Kit, segundo recomendações do fabricante (Applied Biosystems™, UK). As reações de qRT-PCR serão realizadas em triplicata em Stratagene® Mx3005P™ Real-Time PCR System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) utilizando-se SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems™, UK), de acordo com as instruções do fabricante.

4.4.2. Citometria de fluxo e microscopia confocal
A imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico será realizada utilizando Citômetro de fluxo (Attune Acoustic Focusing Cytometer®, Applied Biosystems) e microscópio confocal. As células T helper (CD4+), Células T citotóxico supressor (CD8+) e (CD3) serão determinados usando anticorpos monoclonais (mAbs) (AbD Serotec, Bio-Rad) (DUDEK et al., 2015).

4.5 Análise estatística
Análise de variância (ANOVA) será usada para comparar níveis de anticorpos no teste de ELISA, bem como níveis de expressão de mRNA dos genes para IL-2, IL-13 e IL-17, pela técnica de qRT-PCR e resultados da citometria de fluxo. O teste LSD (ELISA) e teste “t” de Student (qRT-PCR)
serão utilizados para determinar diferenças significativas (P<0,05) entre as médias dos tratamentos. Todos os dados serão expressos pela média ± desvio padrão médio (SEM)

Metas
- Obtenção de um sistema de entrega de fármacos para elaboração das vacinas de mucosa;
- Formulação de vacina com dois diferentes adjuvantes;
- Treinamento de alunos de pós-graduação e graduação;
- Publicação de, pelo menos, dois artigos científicos em periódicos de circulação internacional ou nacional.

Resultados esperados
Espera-se, ao fim da execução deste projeto, a formulação de novas vacinas contra os alphaherpesvirus bovinos tipo 1 e/ou tipo 5 e o vírus da diarreia viral dos bovinos, de aplicação na mucosa vaginal. Esta estratégia deverá tornar as vacinas mais eficientes contra estes antígenos, reduzindo as perdas econômicas (principalmente reprodutivas) decorrentes das enfermidades causadas por estes vírus, uma vez que mimetizam a infecção natural. A aplicação das vacinas deverá estimular de forma mais eficiente o sistema imune de mucosa, o que será mensurado através de ELISA, soroneutralização e qRT-PCR. Além disso, esta abordagem representa o desenvolvimento de uma nova tecnologia de produção de vacinas, que poderá ser adotada na produção de vacinas contra outros patógenos, de outras espécies animais ou mesmo para humanos. Sem a utilização de animais (bovinos) nesta etapa da pesquisa, seria impossível verificar a eficiência das vacinas experimentais propostas, bem como fazer as inferências sugeridas acima.
Os resultados poderão, ainda, ser de interesse de empresas devido ao caráter inovador dos produtos que estarão em desenvolvimento, bem como pela possibilidade de seu patenteamento e exploração comercial devido à importância que possui na prevenção de enfermidades tão importantes para os sistemas pecuários.