Nome do Projeto
Nanopartícula de prata biogênica (Bio-AgNP): ação antimicrobiana contra Staphylococcus spp. multirresistente e aplicação em fórmula farmacêutica de uso tópico
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/04/2021 - 01/07/2022
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Os micro-organismos multirresistentes representam um problema em saúde pública, uma vez que as alternativas terapêuticas utilizadas para combatê-los tornam-se escassas. Staphylococcus aureus resistente à meticilina (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA), apresentam resistência a diversas classes de antimicrobianos, devido a expressão do gene mecA. qual também já foi identificado em isolados de Staphylococcus coagulase negativa (SCN). Os MRSA foram incluídos recentemente em uma lista divulgada pela Organização Mundial da Saúde (OMS), como alta prioridade em pesquisa e desenvolvimento (P&D) de novos medicamentos. Assim, torna-se necessária a busca por substâncias que sejam eficazes no controle deste agente infeccioso. Nesse sentido, a nanotecnologia surge para possibilitar o desenvolvimento de novos fármacos e também de novas estratégias de tratamento para diferentes doenças. Dentre elas, as nanopartículas biogênicas de prata (Bio-AgNP), demonstram ser promissoras devido a suas propriedades cicatrizantes e antimicrobianas, inclusive frente a micro-organismos multirresistentes. Neste estudo, as Bio-AgNP serão avaliadas contra cepa padrão e isolados clínicos de SCN e S. aureus, verificando a determinação da concentração inibitória e bactericida mínima (CIM e CBM), ensaio de Time-kill, cinética de ação, efeito antibiofilme frente as bactérias e a citotoxicidade em células de mamíferos. Serão avaliados também os mecanismos de ação da Bio-AgNP na célula bacteriana através de análise de alteração da morfologia celular, alteração da permeabilidade da membrana, integridade e extravasamento de ácidos nucleicos. Além disso, busca-se com este projeto o desenvolvimento de um produto, baseada na aplicação da Bio-AgNP in vitro, na forma de pomada antimicrobiana para uso tópico, através da avaliação in vivo utilizando ratos Winstar como modelos biológicos. Para isso, serão produzidos ferimentos nos animais, os quais serão contaminados com isolados humanos avaliados no estudo e será conduzido o tratamento das lesões com a pomada proposta durante 14 dias. Os ferimentos serão avaliados após 2, 7 e 14 dias após infecção com relação a viabilidade bacteriana do isolado no ferimento após tratamento e parâmetros histopatológicos a partir de lâminas preparadas dos ferimentos, sendo avaliada a presença de neovascularização, tecido de granulação, células mononucleares, polimorfonucleares, deposição de colágeno e re-epitelização

Objetivo Geral

Geral
Avaliar o efeito in vitro de nanopartículas de prata biogênicas (Bio-AgNP) em cepa padrão e em isolados clínicos de Staphylococcus spp. multirresistentes (MRS) e verificar sua ação in vivo como pomada antibacteriana e cicatrizante utilizando modelo animal.

Específicos
- Determinar concentrações inibitórias e bactericidas (CIM e CBM) e tempo de morte bacteriana induzida pela Bio-AgNP em isolados clínicos de MRS;
- Avaliar os possíveis mecanismos de ação da Bio-AgNP na célula bacteriana;
- Determinar as concentrações inibitórias mínimas da Bio-AgNP nos biofilmes produzidos pelos de isolados de MRS;
- Avaliar a citotoxicidade das Bio-AgNP in vitro utilizando células de mamíferos;
- Formular uma pomada antimicrobiana utilizando as Bio-AgNP;
- Avaliar a ação antibacteriana e cicatrizante da pomada de uso tópico in vivo utilizando ratos infectados com os isolados de MRS.

Justificativa

As doenças infecciosas representam uma das maiores causas de morbidade e mortalidade (WHO, 2018). Dentre as bactérias Gram-positivas de importância clínica, destacam-se as do gênero Staphylococcus. As mesmas são responsáveis pela colonização assintomática de indivíduos saudáveis na população, fazendo parte da microbiota normal da pele e membranas mucosas, podendo ser facilmente transmitido por contato direto ou indireto (CRUZ et al., 2011). São considerados patógenos oportunistas, sendo agentes comuns de pneumonias, osteomelites, endocardites, bacteremias, infecções de pele e intoxicações alimentares (MURRAY, ROSENTHAL e PFALLER, 2017; BRASIL, 2017).
As bactérias pertencentes a esse gênero estão agrupadas de acordo com a capacidade de coagular o plasma sanguíneo, através da enzima coagulase. Dentre os coagulase positiva, Staphylococcus aureus é considerado como a principal espécie do gênero, podendo expressar diferentes toxinas de ação citolíticas, como a α-hemolisina, Leucocidina de Panton Valentin (PVL), Toxina da Síndrome do Choque Tóxico (TSS1), alguns fatores de virulência que auxiliam na evasão do sistema imune do hospedeiro, como a proteína A e também diferentes enterotoxinas, responsáveis por intoxicações alimentares (MURRAY, ROSENTHAL e PFALLER, 2017).
A patogênese de Staphylococcus coagulase negativa (SCN) está associada principalmente a sua capacidade de formar biofilmes em diversas superfícies, bióticas ou abióticas, estando relacionado com infecções em pacientes que utilizam dispositivos médicos invasivos. Além disso, os mesmos vêm demonstrando cada vez mais resistência a diferentes antimicrobianos, contribuindo para o aumento da morbidade e mortalidade de infecções nosocomiais (HEILMANN, ZIEBUHR e BECKER, 2018).
No ambiente hospitalar micro-organismos multirresistentes, representam um grande problema em saúde pública, uma vez que as alternativas terapêuticas que podem ser utilizadas contra os mesmos tornam-se bastante restritas (MARRA et al., 2011). Dentre elas, cepas de Staphylococcus spp. multirresistentes (MRS) como S. aureus resistente à meticilina (MRSA) são as principais causadoras de infecções nosocomiais, apresentando resistência a penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos e monobactâmicos, devido a expressão do gene mecA, o qual também já foi identificado em isolados clínicos de Staphylococcus coagulase negativa (SCN) (CORREAL et al., 2013; ROCA, 2013).
Dentre os fatores de virulência que MRS podem expressar, a capacidade de formar biofilmes é uma das mais importantes. Essa habilidade possibilita a persistência dos micro-organismos no ambiente por mais tempo, servindo como fonte para futuras contaminações e permite uma maior resistência aos antimicrobianos e produtos sanitizantes. A formação de biofilme facilita ainda a troca de genes que codificam fatores de virulência e resistência a diferentes fármacos (COSTERTON, MONTANARO e ARCIOLA, 2005; MADSEN et al., 2012; SAVAGE, CHOPRA e O’NEIL, 2013).
De acordo com Weintrob et al. (2015), métodos convencionais de descolonização de MRSA, como uso tópico de antimicrobianos convencionais, não são eficazes, sendo necessária novas alternativas terapêuticas. Assim, a busca por novas substâncias eficazes no controle desses agentes é um desafio de alta prioridade pela Organização Mundial da Saúde (OMS), sendo necessários estudos que busquem avaliar novas alternativas (KARROUCHI et al., 2018).
Nesse sentido, a nanotecnologia surge para possibilitar o desenvolvimento de novos fármacos e também de novas estratégias de tratamento para diferentes doenças. Alguns estudos recentes vêm demonstrando resultados relevantes quanto a ação de nanopartículas (NP) associadas a matrizes poliméricas no processo de cicatrização de ferimentos, como NP de prata (Ag), cobre (Cu) e óxido de ferro (FeO) (LU et al., 2018; MEHRABANI et al., 2018; ZHAI et al., 2018).
Contudo, as nanopartículas de prata (AgNPs) demonstram-se como promissoras devido a suas propriedades antimicrobianas, inclusive frente a micro-organismos multirresistentes (RAHIMI et al., 2020). Apesar de não ser bem elucidado, acredita-se que as AgNP apresentam a capacidade de penetrar na membrana celular, ou se fixar a superfície bacteriana, levando ao rompimento e induzindo morte da célula. Além disso, são altamente tóxicas para a célula bacteriana e sua eficiência é aumentada pela diminuição do tamanho da partícula (MENOM, et al., 2017; SIDDIQI, et al., 2018; SINGH, et al., 2015).
A síntese das AgNPs podem ser feitas a partir de métodos químicos, físicos ou biológicos, sendo esse último o mais vantajoso devido as rotas de síntese serem simples, econômicas, ecologicamente corretas e com alto rendimento, através da utilização de tecnologia verde, gerando podutos não-tóxicos (RAHIMI et al., 2020). As AgNPs obtidas através de síntese biológica, são chamadas de biogênicas (Bio-AgNPs) e utilizam extratos vegetais ou micro-organismos, como o fungo Fusarium oxysporum (SIDDIQI, HUSEN e RAO, 2018; VALENTE, et al., 2018).
Em alguns casos de infecções de pele, dependendo do estado imunológico do hospedeiro e de fatores como o uso de antimicrobianos e diabetes, pode haver uma maior pré-disposição a colonização por S. aureus e SCN, até mesmo por estirpes multirresistentes, podendo estimular a formação de biofilmes, dificultando o tratamento do ferimento. Além disso, podem contribuir para o desenvolvimento de feridas crônicas e agudas, dificultando a cicatrização do tecido lesado e elevando as taxas de morbidade e mortalidade associadas a essas enfermidades (HOTTERBEEKX et al, 2017; YUAN et al., 2019).
O uso de antibacterianos de forma sistêmica pode auxiliar a reduzir a carga bacteriana, entretanto, nem sempre é possível que penetrem nos ferimentos de forma eficaz (YUAN et al., 2019; RAHIMI et al., 2020). Nesse sentido, produtos farmacológicos de uso tópico como pomadas, podem servir como alternativas a essa problemática, uma vez que é possível adicionar a sua composição componentes antimicrobianos, preferencialmente de baixa toxicidade e que possam auxiliar o processo de regeneração tecidual, como a Bio-AgNP (RAKHSHAEI e NAZAMI, 2017;).
Desta forma, considerando as taxas de morbidade e mortalidade relacionadas a infecções nosocomais causadas por MRS, e também os efeitos já descritos na literatura sobre Bio-AgNP, sua aplicação em fórmulas farmacêuticas de uso tópico são uma alternativa para o controle desses micro-organismos, uma vez que as infecções originadas por eles, na maioria das vezes, iniciam-se na pele e, além disso, podem auxiliar no processo de cicatrização do ferimento.

Metodologia

Isolados bacterianos: erão utilizados 20 isolados clínicos de Staphylococcus spp. multirresistentes pertencentes ao Laboratório de Bacteriologia e Bioensaios (LaBBio) da UFPel. A identificação dos isolados foi feita através do VITEK® 2 GN System (bioMérieux, France) e também foram caracterizados quando ao seu perfil de resistência a antimicrobianos, presença do gene de multirresistência mecA e formação de biofilme in vitro (CUNHA, 2017). Além disso, serão utilizadas as cepas padrão S. aureus ATCC 25923 e S. epidermidis ATCC 35984 como controles.

Síntese das nanopartículas de prata biogênicas (Bio-AgNP): Bio-AgNP será formulada pelo método proposto por Durán et al. (2005), de acordo com a patente 0605681-4A2 (2006). Será preparada uma redução do nitrato de prata por Fusarium oxysporum estirpe 551 no Laboratório de Genética Molecular de ESALQ-USP (Piracicaba, São Paulo, Brasil).

Determinação da concentração inibitória e bactericida mínima (CIM e CBM) em isolados humanos de MRSA: CIM será determinada através da Técnica de Microdiluição em Caldo em placas de poliestireno como estabelecido pelo Clinical and Laboratory Standards Institure (2018). Serão feitas diluições de razão dois da Bio-AgNP em Caldo BHI (Brain and Hearth Infusion – Kasvi®) variando de 0,02-30 μg/mL e, em seguida, serão adicionados 50 μL do inóculo bacteriano preparado a partir de suspensão em solução salina (1,5x108 UFC/mL) o qual será diluído em caldo BHI (1:20). Como controles serão utilizados o meio de cultivo, meio de cultivo acrescido do inóculo bacteriano.

Ensaio de tempo de morte bacteriana (Time-Kill Assay): a curva de morte será determinada de acordo com a metodologia proposta por Daniel-Jambun et al. (2019). Para tal, suspensões bacterianas (106 UFC/mL) obtidas a partir de cultura recente (18-24h) serão submetidas a diferentes concentrações das Bio-AgNP, conforme determinado na CIM, sendo elas 1xCIM, 2xCIM e 4xCIM em 5mL de caldo BHI (Kasvi®). As coletas para esta determinação serão feitas nos tempos 0 min, 15 min, 30 min, 2h, 4h, 8h, 24h e 48h e ou até ser observada a ausência de células viáveis.

Alteração da morfologia celular bacteriana: para observar alterações na morfologia celular será utilizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV). As células bacterianas serão submetidas as concentrações da Bio-AgNP previamente determinadas nos testes anteriores, serão centrifugadas, lavadas com PBS 0,1 M três vezes e desidratadas em concentrações crescentes de etanol (30%, 50%, 80%, 90% e 100%). Após, o mesmo será substituído por álcool butílico (Sigma®) e em seguida as amostras serão revestidas por partículas de ouro e submetidas a MEV (LI et al., 2019).

Permeabilidade da membrana: a permeabilidade da membrana celular será determinada através da condutividade elétrica relativa segundo Diao et al. (2014) com auxílio de condutivímetro (HANNA® – HI98311). Para tal, serão utilizados cultivos de 10h dos isolados bacterianos em estudo, os quais serão centrifugados a 5.000 x g por 10 min, posteriormente o pellet será lavado com uma solução de glicose 5% (Synth ®) até a condutividade elétrica ficar semelhante à da glicose. Posteriormente serão adicionadas concentrações nas NPs definidas anteriormente e incubadas por 8h a 37°C, sendo denominado tratamento L2. Concomitante ao tratamento L2, será realizado o L1, que corresponderá as concentrações das moléculas na solução de glicose 5% (ausência do pellet) e tratamento L0, que será o pellet em solução de glicose 5% (sem molécula) após fervura por 5 min. A permeabilidade da membrana será calculada através da variação no percentual da condutividade elétrica (V%) de acordo com a equação: V% = (L2-L1/L0) x 100.

Integridade da membrana celular e extravasamento de ácidos nucléicos: a integridade da membrana celular será determinada pela detecção de componentes celulares no sobrenadante conforme descrito por Diao et al. (2014). A partir de cultura recente dos isolados bacterianos em BHI (Kasvi ®) (18- 24h) será feita a centrifugação das mesmas por 1 min a 5.000 x g e posteriormente, será realizada lavagem com água destilada estéril, e serão suspendidas em 100mL de PBS, as quais serão tratadas com concentrações das moléculas determinadas anteriormente, sendo incubada por 4h a 37°C. Posteriormente será feita a análise do sobrenadante para proteínas (BRADFORD, 1976) e para açúcares redutores em espectofotômetro (MILLER, 1959). Para análise de ácidos nucléicos, o sobrenadante será submetido a espectofotometria de UV a 260nm, sendo os controles PBS e PBS acrescido das concentrações das NPs.

Determinação da concentração inibitória e bactericida mínima do biofilme (CIMB e CBMB): Para determinar a CIMB e CBMB será utilizada a metodologia proposta por Cafiso et. al (2010) e adaptada por Reiter et. al (2012). Para isso serão preparados inóculos bacterianos (1,5x108 UFC/mL) de cultura recente (18-24h) dos micro-organismos em estudo e a partir disso, será adicionado 20μL do mesmo em 180μL de Caldo Trypcase Soya Broth (TSB, Acumedia ®), sendo incubado por 24h a 36°C. Após o período de incubação, as células não aderidas serão removidas e as placas serão lavadas cuidadosamente com solução salina estéril três vezes. Posteriormente será adicionado o meio de cultura com as diluições das moléculas mencionadas anteriormente e incubadas nas mesmas condições. A CIM será considerada como a concentração da molécula em que não será observado crescimento visível. Para determinar a CBMB será removido o caldo TSB com as diferentes concentrações das moléculas e em seguida será adicionado 100μL do meio de cultura, sendo incubado 24h a 36°C. A CBMB será considerada como a menor concentração em que a bactéria não crescerá após a exposição à concentração das moléculas, impedindo a formação de biofilme. Os testes serão feitos em triplicata.

Citotoxicidade in vitro: A citotoxicidade das moléculas será avaliada em células da linhagem VERO (Monkey African Green Kidney) e HaCaT (Human epidermal keratinocyte), as quais serão cultivadas em caldo MEM (Minimum Essential Medium, Sigma-Aldrich ®) e posteriormente serão coletadas por tripsinização, centrifugadas e contadas em câmara de Neubauer, ajustando a concentração celular para 105 células/mL. Esta quantidade de células será suspendida no mesmo meio de cultivo incubadas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por 48h. As moléculas serão adicionadas em diluições de razão dois (0,02-30 μg/mL) e as células incubadas novamente nas mesmas condições por 24h. Após o período de incubação será adicionado o corante Alamar Blue, o qual permitirá a leitura visual devido a alteração da cor, onde a coloração azul indicará morte celular (oxidada) e a cor rosa células viáveis (ILHA et al., 2008).

Elaboração da pomada antibacteriana com Bio-AgNP: para elaboração da pomada, os ingredientes da fase oleosa, sendo eles ácido esteárico (16%), parafina líquida (15%) e álcool cetostearílico (1,5%) e da fase aquosa, sendo hidróxido de sódio 20% (4%), glicerol (50%), polisorbato 20 (3%) e água destilada, serão aquecidos a 70°C em um agitador magnético por 10min, até ser formada a base da pomada. Após isso, serão adicionadas duas concentrações da Bio-AgNP (2xCIM e 4xCIM), gerando duas formulações, sendo misturadas a base da pomada em agitador magnético por 5min. Após isso, as pomadas serão armazenadas em frascos âmbar a 20°C em ambiente escuro (GHOSH, BHATTACHARJEE e DAS, 2016).

Ensaio antibacteriano e cicatrizante in vivo: todos os experimentos in vivo serão conduzidos de acordo como as regulamentações, políticas e princípios do Conselho Nacional para Controle de Experimentação Animal do Brasil (CONCEA, n° 11.794) e o do manual estabelecido pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas (CEEA UFPel). O projeto foi aprovado pelo CEEA da UFPel (CEEA 11328-2020). Serão utilizados ratos machos Wistar (Rattus norvegicus, Rodentia, Mammalia), com doze semanas de idade, os quais serão ndividualmente mantidos em gaiolas de plástico, sob temperatura controlada (22°C) e fotoperíodo de 12h, sendo o fornecimento de água e alimento Ad libtum. Os animais serão separados em quatro grupos com oito animais cada, sendo eles: grupo infectado não tratado (GCN), grupo infectado e tratado com pomada dermatológica Sulfato de Noemicina+Bacitracina Zíncica (Medley ®) (GCP), grupo infectados e tratado com a pomada com Bio-AgNP de acordo com as concentrações que serão determinadas nos ensaios in vitro (GT1) e um grupo infectado e tratado com a pomada sem a Bio-AgNP (GT2). Os animais serão avaliados nos períodos de 2, 7 e 14 dias após o início do tratamento, sendo necessários 96 animais (n=8 x 4 grupos x 3 períodos experimentais). Para o desenvolvimento das lesões, os animais serão anestesiados com aplicação peritoneal de cloridrato de cetamina (75mg/kg) e xilazina (10mg/kg). Após isso, será feita a tricotomia na região dorsal, seguida da antissepsia com iodopovidona 1% e posteriormente será produzida a ferida cutânea com auxílio de um “punch” metálico de 8,0 mm de diâmetro, delimitando-se a uma área na região dorsal do tórax e removendo-se o segmento circular de pele com tesoura de pontas tipo fina/fina e pinça de dissecção, até sua ressecção, expondo as fáscias musculares. Após o desenvolvimento das lesões, será induzida a infecção por um isolado clínico de Staphylococcus spp. utilizados nesse estudo através da adição de 10μL de suspensão bacteriana (108xUFC/mL-1) (MASSIERO et al., 2015; HEUNIS, SMITH e DICKS, 2013). Os tratamentos serão iniciados após 24 h do momento inicial da infecção, sendo ministrados uma vez ao dia, durante os períodos experimentais. Após o final do período de tratamento dos grupos nos 2, 7 e 14 dias será feita a eutanásia dos animais e biopsia dos ferimentos. Será avaliada a carga bacteriana das lesões. As lesões serão fotografadas diariamente e a área mensurada com auxílio de um paquímetro. Os ferimentos também serão avaliados com relação a histopatologia.

Indicadores, Metas e Resultados

Meta
Desenvolver e avaliar uma pomada antibacteriana incorporada com Bio-AgNP quanto ao seu potencial cicatrizante e uso no controle de infecções de pele causadas por Staphylococcus spp. multirresistentes, a fim de tratar os ferimentos e prevenir possíveis infecções mais graves como bacteremia e sepse.

Resultados esperados e principais contribuições científicas da proposta
Espera-se que a Bio-AgNP demonstre resultados satisfatórios com relação ao seu efeito cicatrizante e antibacteriano frente a isolados humanos de Staphylococcus spp. multirresistentes, bem como, compreender os mecanismos de ação na célula bacteriana. Além disso, com esta proposta pretendemos desenvolver um medicamento de uso tópico, com efeito cicatrizante e antimicrobiano. Como produtos do projeto de tese, pretende-se publicar pelo menos dois artigos científicos como os resultados obtidos, um para os experimentos in vitro e outro para os in vivo, além de um artigo de revisão de literatura. As publicações serão submetidas à periódicos de circulação internacional. Como neste projeto propõem-se o desenvolvimento de um produto, pretendemos redigir pelo menos uma patente sobre a formulação farmacêutica desenvolvida.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
AMILTON CLAIR PINTO SEIXAS NETO
DAIANE DRAWANZ HARTWIG1
DÉBORAH TROTA FARIAS DE ALBERNAZ
Kamila Furtado da Cunha
Kamila Furtado da Cunha
MARCELLE OLIVEIRA GARCIA
SUZANE OLACHEA ALLEND

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