Nome do Projeto
Alterações epigenéticas em plantas de arroz submetidas ao estresse salino
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
18/03/2021 - 18/03/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
A salinização do solo é um dos principais fatores ambientais que influenciam negativamente a produtividade, o que pode reduzir substancialmente a produção de alimentos, particularmente para culturas sensíveis, como o arroz. Embora a variação da sequência de DNA seja a principal força evolutiva subjacente às variações fenotípicas, as alterações epigenéticas podem afetar a expressão dos genes e estabilidade do genoma e, portanto, também podem contribuir para variações de traços que podem ser herdados para as gerações seguintes. Portanto, o objetivo deste estudo é investigar a expressão relativa de genes envolvidos no processo de metilação/desmetilação ativa do DNA, além de quantificar os níveis globais de metilção do DNA em plantas de Oryza sativa L. submetidas ao estresse salino. Para isso, quatro cultivares contrastantes à salinidade serão submetidas a 150mM de NaCl durante o estádio vegetativo V3 e após 11 dias de estresse folhas e raízes serão coletadas. Serão realizadas análises de conteúdo de Na+ e K+, conteúdo relativo de água, além da quantificação da expressão de genes envolvidos no processo de metilação/desmetilação ativa do DNA e quantificação dos níveis globais de metilção do DNA.
Objetivo Geral
Investigar a expressão relativa de genes envolvidos no processo de metilação/desmetilação ativa do DNA, além de quantificar os níveis globais de metilção do DNA em folhas e raízes de 4 genótipos de Oryza sativa L. contrastantes em relação a salinidade e submetidas a 150mM de NaCl.
Justificativa
A salinização do solo é um dos principais fatores ambientais que influenciam negativamente a produtividade, o que pode reduzir substancialmente a produção de alimentos, particularmente para culturas sensíveis, como arroz (MUNNS; TESTER, 2008; ISMAIL; HORIE, 2017). Aproximadamente 6,5% da área total do mundo e cerca de 45 milhões de hectares de terras irrigadas são afetados pelo excesso de sais, e isso deve aumentar devido às mudanças climáticas e como consequência de práticas de irrigação (RENGASAMY, 2010). Os efeitos adversos do estresse salino possuem duas causas principais: primeiro, o estresse osmótico reduz a absorção de água pelas raízes, que ocorre em questão de minutos a dias, causando o fechamento estomático e a inibição da expansão celular; a segunda fase ocorre ao longo de dias ou semanas, ocasionando o acúmulo de sais (toxicidade iônica) que prejudicam os processos metabólicos, provocando senescência prematura, ou até mesmo morte celular (MUNNS; TESTER, 2008).
O Na+ é um importante elemento tóxico que pode se acumular em níveis elevados em solos afetados pelo sal. Durante o estresse salino, plantas sensíveis geralmente preferem manter baixo Na+ na parte aérea, e os mecanismos de exclusão deste cátion da parte aérea são cruciais para a sobrevivência dessas plantas em ambientes afetados pelo sal (MUNNS; TESTER, 2008). Portanto, características do transporte de Na+ que se correlacionam com a sobrevivência em ambientes salinos e as proteínas mediadoras desses processos têm sido alvo de estudo intensivo (ISMAIL; HORI, 2017).
Embora a variação da sequência de DNA seja a principal força evolutiva subjacente às variações fenotípicas, as alterações epigenéticas podem afetar a expressão dos genes e, portanto, também podem contribuir para variações de traços que podem ser herdados para as gerações seguintes (BECKER; WEIGEL, 2012). Tais alelos epigenéticos estavelmente herdados são conhecidos como epialelos e podem levar a variações nos níveis fenotípicos e moleculares (HE et al., 2018). A epigenética refere-se ao estudo de modificações hereditárias ou estáveis no genoma que não são mediadas por mudanças na sequência de DNA subjacente, sendo importantes para regulação gênica e estabilidade do genoma. Essas modificações incluem alterações covalentes reversíveis no DNA e histonas, como metilação e acetilação, e algumas alterações de RNA não codificantes (ncRNA), influenciando a estrutura da cromatina e, por sua vez, a acessibilidade à informação genética (IWASAKI; PASZKOWSKI, 2014; ZHANG et al., 2018).
Em plantas, a metilação do DNA ocorre em todos os contextos de sequência de resíduos de citosina: CG, CHG e CHH (onde H representa A, T ou C), sendo uma marca epigenética crucial e generalizada nos genomas vegetais (ZHANG et al., 2018). A metilação de novo do DNA é mediada pela via de metilação do DNA dirigida pelo RNA (RdDM), envolvendo pequenos RNAs de interferência (siRNAs), proteínas (por exemplo, RNA POLIMERASE IV, PROTEÍNA TIPO DICER e ARGONAUTE), e enzimas METILASE REARRANJADAS DE DOMÍNIOS (DRMs), que catalisam a metilação do DNA de maneira independente da sequência (Zhong et al. 2014, Zhang et al. 2018). A manutenção da metilação do DNA depende do contexto da sequência da citosina e é catalisada por enzimas chamadas DNA metiltransferases. A metilação da citosina no contexto CG é mantida pela METILTRANSFERASE 1 (MET1), que é recrutada no DNA pelas proteínas VARIANTE NA METILAÇÃO, e pela DNA (citosina-5) -metiltransferase 1 (DNMT) (Woo et al. 2007, Woo et al. 2008). A manutenção da metilação de CHG é catalisada por cromometilase DNA metiltransferases (CMTs), enquanto para o contexto de CHH a metilação é mantida por DRM ou CMT, dependendo da região genômica (Lindroth et al. 2001, Stroud et al. 2014, Zhang et al. 2018).
A desmetilação do DNA pode ser um processo passivo ou ativo. A desmetilação passiva do DNA resulta da falta de um doador do grupo metil ou da falta de atividade das enzimas metiltransferase durante a replicação do DNA, resultando na falha em manter os níveis de metilação (Rocha et al. 2005). A desmetilação ativa é um processo mais complexo no qual um grupo 5-metil é removido por meio da ação da enzima DNA glicosilase/liase (Niehrs 2009). No genoma do arroz, seis DNA glicosilases que podem excisar 5-mC em todos os contextos de sequência de citosina foram encontradas: quatro REPRESSOR DE SILÊNCIO 1 (ROS1a, ROS1b, ROS1c e ROS1d) e dois DEMETER-LIKE 3 (DML3a e DML3b) (Agius et al. 2006, Penterman et al. 2007).
Portanto, devido a importância na regulação da expressão gênica e nos processos de estabilidade do genoma, a hipótese deste estudo é que cultivares mais tolerantes ao estresse salino terão uma alteração nos padrões de expressão dos genes envolvidos no processo de metilação/desmetilaão, e que isso contribuirá para manutenção dos níveis globais de metilação do DNA, e consequentemente uma maior estabilidade do genoma.
O Na+ é um importante elemento tóxico que pode se acumular em níveis elevados em solos afetados pelo sal. Durante o estresse salino, plantas sensíveis geralmente preferem manter baixo Na+ na parte aérea, e os mecanismos de exclusão deste cátion da parte aérea são cruciais para a sobrevivência dessas plantas em ambientes afetados pelo sal (MUNNS; TESTER, 2008). Portanto, características do transporte de Na+ que se correlacionam com a sobrevivência em ambientes salinos e as proteínas mediadoras desses processos têm sido alvo de estudo intensivo (ISMAIL; HORI, 2017).
Embora a variação da sequência de DNA seja a principal força evolutiva subjacente às variações fenotípicas, as alterações epigenéticas podem afetar a expressão dos genes e, portanto, também podem contribuir para variações de traços que podem ser herdados para as gerações seguintes (BECKER; WEIGEL, 2012). Tais alelos epigenéticos estavelmente herdados são conhecidos como epialelos e podem levar a variações nos níveis fenotípicos e moleculares (HE et al., 2018). A epigenética refere-se ao estudo de modificações hereditárias ou estáveis no genoma que não são mediadas por mudanças na sequência de DNA subjacente, sendo importantes para regulação gênica e estabilidade do genoma. Essas modificações incluem alterações covalentes reversíveis no DNA e histonas, como metilação e acetilação, e algumas alterações de RNA não codificantes (ncRNA), influenciando a estrutura da cromatina e, por sua vez, a acessibilidade à informação genética (IWASAKI; PASZKOWSKI, 2014; ZHANG et al., 2018).
Em plantas, a metilação do DNA ocorre em todos os contextos de sequência de resíduos de citosina: CG, CHG e CHH (onde H representa A, T ou C), sendo uma marca epigenética crucial e generalizada nos genomas vegetais (ZHANG et al., 2018). A metilação de novo do DNA é mediada pela via de metilação do DNA dirigida pelo RNA (RdDM), envolvendo pequenos RNAs de interferência (siRNAs), proteínas (por exemplo, RNA POLIMERASE IV, PROTEÍNA TIPO DICER e ARGONAUTE), e enzimas METILASE REARRANJADAS DE DOMÍNIOS (DRMs), que catalisam a metilação do DNA de maneira independente da sequência (Zhong et al. 2014, Zhang et al. 2018). A manutenção da metilação do DNA depende do contexto da sequência da citosina e é catalisada por enzimas chamadas DNA metiltransferases. A metilação da citosina no contexto CG é mantida pela METILTRANSFERASE 1 (MET1), que é recrutada no DNA pelas proteínas VARIANTE NA METILAÇÃO, e pela DNA (citosina-5) -metiltransferase 1 (DNMT) (Woo et al. 2007, Woo et al. 2008). A manutenção da metilação de CHG é catalisada por cromometilase DNA metiltransferases (CMTs), enquanto para o contexto de CHH a metilação é mantida por DRM ou CMT, dependendo da região genômica (Lindroth et al. 2001, Stroud et al. 2014, Zhang et al. 2018).
A desmetilação do DNA pode ser um processo passivo ou ativo. A desmetilação passiva do DNA resulta da falta de um doador do grupo metil ou da falta de atividade das enzimas metiltransferase durante a replicação do DNA, resultando na falha em manter os níveis de metilação (Rocha et al. 2005). A desmetilação ativa é um processo mais complexo no qual um grupo 5-metil é removido por meio da ação da enzima DNA glicosilase/liase (Niehrs 2009). No genoma do arroz, seis DNA glicosilases que podem excisar 5-mC em todos os contextos de sequência de citosina foram encontradas: quatro REPRESSOR DE SILÊNCIO 1 (ROS1a, ROS1b, ROS1c e ROS1d) e dois DEMETER-LIKE 3 (DML3a e DML3b) (Agius et al. 2006, Penterman et al. 2007).
Portanto, devido a importância na regulação da expressão gênica e nos processos de estabilidade do genoma, a hipótese deste estudo é que cultivares mais tolerantes ao estresse salino terão uma alteração nos padrões de expressão dos genes envolvidos no processo de metilação/desmetilaão, e que isso contribuirá para manutenção dos níveis globais de metilação do DNA, e consequentemente uma maior estabilidade do genoma.
Metodologia
Material vegetal e estresse salino
As sementes de arroz serão germinadas em rolo de papel em câmara de crescimento do tipo BOD, com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro e temperatura de 28±2°C, sendo assim mantidas por sete dias. Para este estudo serão utilizadas quatro cultivares, sendo uma cultivar sensível (BRS 358) e uma tolerante (BRS Bojuru) à salinidade, e mais duas selecionadas devido suas altas produtividades e qualidades dos grãos (BRS Pampa CL e BRS Pampeira).
Após germinadas, as plântulas serão transplantadas para flutuadores de isopor que serão colocados em bandejas de 20L contendo água destilada, e mantidas em casa de vegetação. Os flutuadores de isopor consistirão de 100 furos em uma grade de 10 linhas x10 colunas, sendo uma plântula por furo. Após 3 dias, serão transferidas para a solução de Yoshida (1976) ajustada para pH 5,0, a qual será monitorada e ajustada diariamente com HCl/KOH e atualizada semanalmente (PLATTEN et al., 2013). Ao atingirem o estádio de desenvolvimento V3, será adicionado 150 (mM) de NaCl, exceto para o tratamento controle que seguirá apenas com solução nutritiva.
Após 11 dias de estresse, serão avaliados o standard evaluation score (SES) de lesão visual por sal e categorizar a tolerância ao sal seguindo o método descrito por Gregorio et al. (1997) e IRRI (2002), além de uma contagem do número de plantas sobreviventes, e posteriormente folhas e raízes serão coletadas para análises futuras.
O experimento será conduzido em delineamento inteiramente ao acaso em fatorial duplo (4 genótipos x 2 tratamentos), com quatro repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída de uma bandeja com 25 plantas de cada genótipo, totalizando 100 plantaspor tratamento.
Conteúdo de Na+ e K+
O material vegetal será seco durante pelo menos 48h em estufa a 80ºC, e encubado em ácido nítrico (HNO3) e ácido perclórico (HClO4) na proporção de 2:1 para extração dos íons. As concentrações de Na+ e K+ serão mensuradas por um espectrofotômetro de chama (mg g-1 MS).
Extração de RNA Total, síntese de cDNAe RT-qPCR
O RNA total será extraído de 0,1 g de tecido foliar usando o kit TRIzol™ Reagent (Invitrogen ™, Carlsbad, EUA). Os RNAs isolados serão tratados com DNAse I (Invitrogen ™, Carlsbad, EUA) para eliminar qualquer traço de DNA genômico. A qualidade, quantidade e pureza do RNA total serão avaliadas através de eletroforese em gel de agarose a 1% e espectrofotômetro NanoVue (GE Healthcare).
A primeira cadeia de cDNA será sintetizada a partir de 1 µg de RNA total utilizando o kit iScript™ Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR (BioRad™). A PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) será realizada utilizando o Bio-Rad CFX (Hercules, EUA) e o kit GoTaq® qPCR Master Mix (Promega™, USA) que contém o fluoróforo BRYT Green® Dye. A quantificação relativa da expressão dos genes envolvidos no processo de metilação/desmetilação serão obtidas conforme descrito por Livak e Schmittgen (2001), e os genes UBQ10 e UBC-E2 serão utilizados como genes de referência (MORAES et al., 2015; AULER et al., 2016).
Para o desenho dos primers será utilizado programa Primer Express 3.0 (Applied Biosystems), os quais serão avaliados quanto a especificidade (melting curve) e eficiência.
Quantificação da metilação global do DNA - 5 - metilcitosina (%)
O DNA genômico total será extraído de tecidos foliares e radiculares pelo método CTAB (Murray e Thompson, 1980) e quantificado em espectrofotômetro NanoVue (GE Healthcare ™).
A quantificação dos níveis globais de metilação do DNA será obtida com um ensaio baseado em ELISA usando o kit comercial 5-mC DNA ELISA Kit (Zymo Research™). O procedimento seguirá as instruções do fabricante. Aproximadamente 100 ng de DNA genômico por amostra serão imobilizados em poços com alta afinidade de DNA (placa de 96 poços) e incubados a 37 °C. O DNA metilado será detectado usando anticorpos diluídos e reagentes otimizados com alta especificidade para 5 mC e então quantificado calorimetricamente.
A absorbância será lida em um leitor de microplaca a 450 nm (Biotek Power Wave XS ™) e a porcentagem de metilação do DNA será calculada em relação a uma curva padrão, fornecida no kit e utilizando a seguinte equação: % 5-mC = e {(absorbance – y-intercept)/slope}.
Análise estatística
Os dados serão submetidos à análise de variância (P ≤ 0,05), e médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Análises estatísticas serão realizadas utilizando o software R studio (RSTUDIO TEAM, 2015).
As sementes de arroz serão germinadas em rolo de papel em câmara de crescimento do tipo BOD, com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro e temperatura de 28±2°C, sendo assim mantidas por sete dias. Para este estudo serão utilizadas quatro cultivares, sendo uma cultivar sensível (BRS 358) e uma tolerante (BRS Bojuru) à salinidade, e mais duas selecionadas devido suas altas produtividades e qualidades dos grãos (BRS Pampa CL e BRS Pampeira).
Após germinadas, as plântulas serão transplantadas para flutuadores de isopor que serão colocados em bandejas de 20L contendo água destilada, e mantidas em casa de vegetação. Os flutuadores de isopor consistirão de 100 furos em uma grade de 10 linhas x10 colunas, sendo uma plântula por furo. Após 3 dias, serão transferidas para a solução de Yoshida (1976) ajustada para pH 5,0, a qual será monitorada e ajustada diariamente com HCl/KOH e atualizada semanalmente (PLATTEN et al., 2013). Ao atingirem o estádio de desenvolvimento V3, será adicionado 150 (mM) de NaCl, exceto para o tratamento controle que seguirá apenas com solução nutritiva.
Após 11 dias de estresse, serão avaliados o standard evaluation score (SES) de lesão visual por sal e categorizar a tolerância ao sal seguindo o método descrito por Gregorio et al. (1997) e IRRI (2002), além de uma contagem do número de plantas sobreviventes, e posteriormente folhas e raízes serão coletadas para análises futuras.
O experimento será conduzido em delineamento inteiramente ao acaso em fatorial duplo (4 genótipos x 2 tratamentos), com quatro repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída de uma bandeja com 25 plantas de cada genótipo, totalizando 100 plantaspor tratamento.
Conteúdo de Na+ e K+
O material vegetal será seco durante pelo menos 48h em estufa a 80ºC, e encubado em ácido nítrico (HNO3) e ácido perclórico (HClO4) na proporção de 2:1 para extração dos íons. As concentrações de Na+ e K+ serão mensuradas por um espectrofotômetro de chama (mg g-1 MS).
Extração de RNA Total, síntese de cDNAe RT-qPCR
O RNA total será extraído de 0,1 g de tecido foliar usando o kit TRIzol™ Reagent (Invitrogen ™, Carlsbad, EUA). Os RNAs isolados serão tratados com DNAse I (Invitrogen ™, Carlsbad, EUA) para eliminar qualquer traço de DNA genômico. A qualidade, quantidade e pureza do RNA total serão avaliadas através de eletroforese em gel de agarose a 1% e espectrofotômetro NanoVue (GE Healthcare).
A primeira cadeia de cDNA será sintetizada a partir de 1 µg de RNA total utilizando o kit iScript™ Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR (BioRad™). A PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) será realizada utilizando o Bio-Rad CFX (Hercules, EUA) e o kit GoTaq® qPCR Master Mix (Promega™, USA) que contém o fluoróforo BRYT Green® Dye. A quantificação relativa da expressão dos genes envolvidos no processo de metilação/desmetilação serão obtidas conforme descrito por Livak e Schmittgen (2001), e os genes UBQ10 e UBC-E2 serão utilizados como genes de referência (MORAES et al., 2015; AULER et al., 2016).
Para o desenho dos primers será utilizado programa Primer Express 3.0 (Applied Biosystems), os quais serão avaliados quanto a especificidade (melting curve) e eficiência.
Quantificação da metilação global do DNA - 5 - metilcitosina (%)
O DNA genômico total será extraído de tecidos foliares e radiculares pelo método CTAB (Murray e Thompson, 1980) e quantificado em espectrofotômetro NanoVue (GE Healthcare ™).
A quantificação dos níveis globais de metilação do DNA será obtida com um ensaio baseado em ELISA usando o kit comercial 5-mC DNA ELISA Kit (Zymo Research™). O procedimento seguirá as instruções do fabricante. Aproximadamente 100 ng de DNA genômico por amostra serão imobilizados em poços com alta afinidade de DNA (placa de 96 poços) e incubados a 37 °C. O DNA metilado será detectado usando anticorpos diluídos e reagentes otimizados com alta especificidade para 5 mC e então quantificado calorimetricamente.
A absorbância será lida em um leitor de microplaca a 450 nm (Biotek Power Wave XS ™) e a porcentagem de metilação do DNA será calculada em relação a uma curva padrão, fornecida no kit e utilizando a seguinte equação: % 5-mC = e {(absorbance – y-intercept)/slope}.
Análise estatística
Os dados serão submetidos à análise de variância (P ≤ 0,05), e médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Análises estatísticas serão realizadas utilizando o software R studio (RSTUDIO TEAM, 2015).
Indicadores, Metas e Resultados
Metas:
• 0-6 meses: Aquisição do material de trabalho, estabelecimento dos experimentos e coleta do material;
• 6-18 meses: Extração de ácidos nucleicos (RNA e DNA), síntese de cDNA, e desenho dos primers;
• 18-24 meses: quantificações relativas dos genes envolvidos no processo de metilação (DRM1a, DRM1b, DRM2, DRM3, DNMT2, CMT1, CMT2 e CMT3) e desmetilação ativa (ROS1a, ROS1b, ROS1c, ROS1d, DML3a e DML3b);
• 24-36 meses: Quantificação dos níveis globais de metilação de DNA genômico e redação de artigos científicos.
Espera-se, a partir da execução deste projeto e com os resultados obtidos:
• Aprofundar o conhecimento sobre Epigenética em plantas de arroz submetidas ao estresse salino;
• Contribuir para elucidação dos processos que regulam a metilação do DNA em plantas de arroz submetidas ao estresse salino;
• Aprimorar o conhecimento sobre parâmetros fisiológicos e moleculares de genótipos brasileiros de arroz submetidos ao estresse salino, e consequentemente auxiliar programas de melhoramento genético de arroz.
• Formação e capacitação de recursos humanos através da elaboração de relatórios de iniciação científica, dissertações de mestrado ou teses de doutorado, de alunos dos Programas de Pós-Graduação envolvidos nesta proposta de trabalho;
• Fortalecimento de parcerias já estabelecidas entre os Programas de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal e EMBRAPACLIMA TEMPERADO;
• Disponibilização das informações obtidas para a comunidade científica, por meio da divulgação dos resultados em congressos, seminários e em importantes eventos técnico-científicos, bem como a publicação dos resultados em periódico de renomado conceito.
• 0-6 meses: Aquisição do material de trabalho, estabelecimento dos experimentos e coleta do material;
• 6-18 meses: Extração de ácidos nucleicos (RNA e DNA), síntese de cDNA, e desenho dos primers;
• 18-24 meses: quantificações relativas dos genes envolvidos no processo de metilação (DRM1a, DRM1b, DRM2, DRM3, DNMT2, CMT1, CMT2 e CMT3) e desmetilação ativa (ROS1a, ROS1b, ROS1c, ROS1d, DML3a e DML3b);
• 24-36 meses: Quantificação dos níveis globais de metilação de DNA genômico e redação de artigos científicos.
Espera-se, a partir da execução deste projeto e com os resultados obtidos:
• Aprofundar o conhecimento sobre Epigenética em plantas de arroz submetidas ao estresse salino;
• Contribuir para elucidação dos processos que regulam a metilação do DNA em plantas de arroz submetidas ao estresse salino;
• Aprimorar o conhecimento sobre parâmetros fisiológicos e moleculares de genótipos brasileiros de arroz submetidos ao estresse salino, e consequentemente auxiliar programas de melhoramento genético de arroz.
• Formação e capacitação de recursos humanos através da elaboração de relatórios de iniciação científica, dissertações de mestrado ou teses de doutorado, de alunos dos Programas de Pós-Graduação envolvidos nesta proposta de trabalho;
• Fortalecimento de parcerias já estabelecidas entre os Programas de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal e EMBRAPACLIMA TEMPERADO;
• Disponibilização das informações obtidas para a comunidade científica, por meio da divulgação dos resultados em congressos, seminários e em importantes eventos técnico-científicos, bem como a publicação dos resultados em periódico de renomado conceito.
Equipe do Projeto
Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
---|---|---|---|
ALESSA ROTH DA SILVA | |||
EUGENIA JACIRA BOLACEL BRAGA | 2 | ||
JAQUELINE DA SILVA DOS SANTOS | |||
KATHARINA ROJAHN WICKBOLDT | |||
MARCELO NOGUEIRA DO AMARAL |
Fontes Financiadoras
Sigla / Nome | Valor | Administrador |
---|---|---|
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior | R$ 5.000,00 | Coordenador |
Plano de Aplicação de Despesas
Descrição | Valor |
---|---|
339030 - Material de Consumo | R$ 5.000,00 |