Nome do Projeto
Alterações epigenéticas em plantas de arroz submetidas ao estresse salino
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
18/03/2021 - 18/03/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
A salinização do solo é um dos principais fatores ambientais que influenciam negativamente a produtividade, o que pode reduzir substancialmente a produção de alimentos, particularmente para culturas sensíveis, como o arroz. Embora a variação da sequência de DNA seja a principal força evolutiva subjacente às variações fenotípicas, as alterações epigenéticas podem afetar a expressão dos genes e estabilidade do genoma e, portanto, também podem contribuir para variações de traços que podem ser herdados para as gerações seguintes. Portanto, o objetivo deste estudo é investigar a expressão relativa de genes envolvidos no processo de metilação/desmetilação ativa do DNA, além de quantificar os níveis globais de metilção do DNA em plantas de Oryza sativa L. submetidas ao estresse salino. Para isso, quatro cultivares contrastantes à salinidade serão submetidas a 150mM de NaCl durante o estádio vegetativo V3 e após 11 dias de estresse folhas e raízes serão coletadas. Serão realizadas análises de conteúdo de Na+ e K+, conteúdo relativo de água, além da quantificação da expressão de genes envolvidos no processo de metilação/desmetilação ativa do DNA e quantificação dos níveis globais de metilção do DNA.

Objetivo Geral

Investigar a expressão relativa de genes envolvidos no processo de metilação/desmetilação ativa do DNA, além de quantificar os níveis globais de metilção do DNA em folhas e raízes de 4 genótipos de Oryza sativa L. contrastantes em relação a salinidade e submetidas a 150mM de NaCl.

Justificativa

A salinização do solo é um dos principais fatores ambientais que influenciam negativamente a produtividade, o que pode reduzir substancialmente a produção de alimentos, particularmente para culturas sensíveis, como arroz (MUNNS; TESTER, 2008; ISMAIL; HORIE, 2017). Aproximadamente 6,5% da área total do mundo e cerca de 45 milhões de hectares de terras irrigadas são afetados pelo excesso de sais, e isso deve aumentar devido às mudanças climáticas e como consequência de práticas de irrigação (RENGASAMY, 2010). Os efeitos adversos do estresse salino possuem duas causas principais: primeiro, o estresse osmótico reduz a absorção de água pelas raízes, que ocorre em questão de minutos a dias, causando o fechamento estomático e a inibição da expansão celular; a segunda fase ocorre ao longo de dias ou semanas, ocasionando o acúmulo de sais (toxicidade iônica) que prejudicam os processos metabólicos, provocando senescência prematura, ou até mesmo morte celular (MUNNS; TESTER, 2008).
O Na+ é um importante elemento tóxico que pode se acumular em níveis elevados em solos afetados pelo sal. Durante o estresse salino, plantas sensíveis geralmente preferem manter baixo Na+ na parte aérea, e os mecanismos de exclusão deste cátion da parte aérea são cruciais para a sobrevivência dessas plantas em ambientes afetados pelo sal (MUNNS; TESTER, 2008). Portanto, características do transporte de Na+ que se correlacionam com a sobrevivência em ambientes salinos e as proteínas mediadoras desses processos têm sido alvo de estudo intensivo (ISMAIL; HORI, 2017).
Embora a variação da sequência de DNA seja a principal força evolutiva subjacente às variações fenotípicas, as alterações epigenéticas podem afetar a expressão dos genes e, portanto, também podem contribuir para variações de traços que podem ser herdados para as gerações seguintes (BECKER; WEIGEL, 2012). Tais alelos epigenéticos estavelmente herdados são conhecidos como epialelos e podem levar a variações nos níveis fenotípicos e moleculares (HE et al., 2018). A epigenética refere-se ao estudo de modificações hereditárias ou estáveis no genoma que não são mediadas por mudanças na sequência de DNA subjacente, sendo importantes para regulação gênica e estabilidade do genoma. Essas modificações incluem alterações covalentes reversíveis no DNA e histonas, como metilação e acetilação, e algumas alterações de RNA não codificantes (ncRNA), influenciando a estrutura da cromatina e, por sua vez, a acessibilidade à informação genética (IWASAKI; PASZKOWSKI, 2014; ZHANG et al., 2018).
Em plantas, a metilação do DNA ocorre em todos os contextos de sequência de resíduos de citosina: CG, CHG e CHH (onde H representa A, T ou C), sendo uma marca epigenética crucial e generalizada nos genomas vegetais (ZHANG et al., 2018). A metilação de novo do DNA é mediada pela via de metilação do DNA dirigida pelo RNA (RdDM), envolvendo pequenos RNAs de interferência (siRNAs), proteínas (por exemplo, RNA POLIMERASE IV, PROTEÍNA TIPO DICER e ARGONAUTE), e enzimas METILASE REARRANJADAS DE DOMÍNIOS (DRMs), que catalisam a metilação do DNA de maneira independente da sequência (Zhong et al. 2014, Zhang et al. 2018). A manutenção da metilação do DNA depende do contexto da sequência da citosina e é catalisada por enzimas chamadas DNA metiltransferases. A metilação da citosina no contexto CG é mantida pela METILTRANSFERASE 1 (MET1), que é recrutada no DNA pelas proteínas VARIANTE NA METILAÇÃO, e pela DNA (citosina-5) -metiltransferase 1 (DNMT) (Woo et al. 2007, Woo et al. 2008). A manutenção da metilação de CHG é catalisada por cromometilase DNA metiltransferases (CMTs), enquanto para o contexto de CHH a metilação é mantida por DRM ou CMT, dependendo da região genômica (Lindroth et al. 2001, Stroud et al. 2014, Zhang et al. 2018).
A desmetilação do DNA pode ser um processo passivo ou ativo. A desmetilação passiva do DNA resulta da falta de um doador do grupo metil ou da falta de atividade das enzimas metiltransferase durante a replicação do DNA, resultando na falha em manter os níveis de metilação (Rocha et al. 2005). A desmetilação ativa é um processo mais complexo no qual um grupo 5-metil é removido por meio da ação da enzima DNA glicosilase/liase (Niehrs 2009). No genoma do arroz, seis DNA glicosilases que podem excisar 5-mC em todos os contextos de sequência de citosina foram encontradas: quatro REPRESSOR DE SILÊNCIO 1 (ROS1a, ROS1b, ROS1c e ROS1d) e dois DEMETER-LIKE 3 (DML3a e DML3b) (Agius et al. 2006, Penterman et al. 2007).
Portanto, devido a importância na regulação da expressão gênica e nos processos de estabilidade do genoma, a hipótese deste estudo é que cultivares mais tolerantes ao estresse salino terão uma alteração nos padrões de expressão dos genes envolvidos no processo de metilação/desmetilaão, e que isso contribuirá para manutenção dos níveis globais de metilação do DNA, e consequentemente uma maior estabilidade do genoma.

Metodologia

Material vegetal e estresse salino
As sementes de arroz serão germinadas em rolo de papel em câmara de crescimento do tipo BOD, com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro e temperatura de 28±2°C, sendo assim mantidas por sete dias. Para este estudo serão utilizadas quatro cultivares, sendo uma cultivar sensível (BRS 358) e uma tolerante (BRS Bojuru) à salinidade, e mais duas selecionadas devido suas altas produtividades e qualidades dos grãos (BRS Pampa CL e BRS Pampeira).
Após germinadas, as plântulas serão transplantadas para flutuadores de isopor que serão colocados em bandejas de 20L contendo água destilada, e mantidas em casa de vegetação. Os flutuadores de isopor consistirão de 100 furos em uma grade de 10 linhas x10 colunas, sendo uma plântula por furo. Após 3 dias, serão transferidas para a solução de Yoshida (1976) ajustada para pH 5,0, a qual será monitorada e ajustada diariamente com HCl/KOH e atualizada semanalmente (PLATTEN et al., 2013). Ao atingirem o estádio de desenvolvimento V3, será adicionado 150 (mM) de NaCl, exceto para o tratamento controle que seguirá apenas com solução nutritiva.
Após 11 dias de estresse, serão avaliados o standard evaluation score (SES) de lesão visual por sal e categorizar a tolerância ao sal seguindo o método descrito por Gregorio et al. (1997) e IRRI (2002), além de uma contagem do número de plantas sobreviventes, e posteriormente folhas e raízes serão coletadas para análises futuras.
O experimento será conduzido em delineamento inteiramente ao acaso em fatorial duplo (4 genótipos x 2 tratamentos), com quatro repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída de uma bandeja com 25 plantas de cada genótipo, totalizando 100 plantaspor tratamento.

Conteúdo de Na+ e K+
O material vegetal será seco durante pelo menos 48h em estufa a 80ºC, e encubado em ácido nítrico (HNO3) e ácido perclórico (HClO4) na proporção de 2:1 para extração dos íons. As concentrações de Na+ e K+ serão mensuradas por um espectrofotômetro de chama (mg g-1 MS).

Extração de RNA Total, síntese de cDNAe RT-qPCR
O RNA total será extraído de 0,1 g de tecido foliar usando o kit TRIzol™ Reagent (Invitrogen ™, Carlsbad, EUA). Os RNAs isolados serão tratados com DNAse I (Invitrogen ™, Carlsbad, EUA) para eliminar qualquer traço de DNA genômico. A qualidade, quantidade e pureza do RNA total serão avaliadas através de eletroforese em gel de agarose a 1% e espectrofotômetro NanoVue (GE Healthcare).
A primeira cadeia de cDNA será sintetizada a partir de 1 µg de RNA total utilizando o kit iScript™ Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR (BioRad™). A PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) será realizada utilizando o Bio-Rad CFX (Hercules, EUA) e o kit GoTaq® qPCR Master Mix (Promega™, USA) que contém o fluoróforo BRYT Green® Dye. A quantificação relativa da expressão dos genes envolvidos no processo de metilação/desmetilação serão obtidas conforme descrito por Livak e Schmittgen (2001), e os genes UBQ10 e UBC-E2 serão utilizados como genes de referência (MORAES et al., 2015; AULER et al., 2016).
Para o desenho dos primers será utilizado programa Primer Express 3.0 (Applied Biosystems), os quais serão avaliados quanto a especificidade (melting curve) e eficiência.
Quantificação da metilação global do DNA - 5 - metilcitosina (%)
O DNA genômico total será extraído de tecidos foliares e radiculares pelo método CTAB (Murray e Thompson, 1980) e quantificado em espectrofotômetro NanoVue (GE Healthcare ™).
A quantificação dos níveis globais de metilação do DNA será obtida com um ensaio baseado em ELISA usando o kit comercial 5-mC DNA ELISA Kit (Zymo Research™). O procedimento seguirá as instruções do fabricante. Aproximadamente 100 ng de DNA genômico por amostra serão imobilizados em poços com alta afinidade de DNA (placa de 96 poços) e incubados a 37 °C. O DNA metilado será detectado usando anticorpos diluídos e reagentes otimizados com alta especificidade para 5 mC e então quantificado calorimetricamente.
A absorbância será lida em um leitor de microplaca a 450 nm (Biotek Power Wave XS ™) e a porcentagem de metilação do DNA será calculada em relação a uma curva padrão, fornecida no kit e utilizando a seguinte equação: % 5-mC = e {(absorbance – y-intercept)/slope}.

Análise estatística
Os dados serão submetidos à análise de variância (P ≤ 0,05), e médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Análises estatísticas serão realizadas utilizando o software R studio (RSTUDIO TEAM, 2015).

Indicadores, Metas e Resultados

Metas:
• 0-6 meses: Aquisição do material de trabalho, estabelecimento dos experimentos e coleta do material;
• 6-18 meses: Extração de ácidos nucleicos (RNA e DNA), síntese de cDNA, e desenho dos primers;
• 18-24 meses: quantificações relativas dos genes envolvidos no processo de metilação (DRM1a, DRM1b, DRM2, DRM3, DNMT2, CMT1, CMT2 e CMT3) e desmetilação ativa (ROS1a, ROS1b, ROS1c, ROS1d, DML3a e DML3b);
• 24-36 meses: Quantificação dos níveis globais de metilação de DNA genômico e redação de artigos científicos.

Espera-se, a partir da execução deste projeto e com os resultados obtidos:
• Aprofundar o conhecimento sobre Epigenética em plantas de arroz submetidas ao estresse salino;
• Contribuir para elucidação dos processos que regulam a metilação do DNA em plantas de arroz submetidas ao estresse salino;
• Aprimorar o conhecimento sobre parâmetros fisiológicos e moleculares de genótipos brasileiros de arroz submetidos ao estresse salino, e consequentemente auxiliar programas de melhoramento genético de arroz.
• Formação e capacitação de recursos humanos através da elaboração de relatórios de iniciação científica, dissertações de mestrado ou teses de doutorado, de alunos dos Programas de Pós-Graduação envolvidos nesta proposta de trabalho;
• Fortalecimento de parcerias já estabelecidas entre os Programas de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal e EMBRAPACLIMA TEMPERADO;
• Disponibilização das informações obtidas para a comunidade científica, por meio da divulgação dos resultados em congressos, seminários e em importantes eventos técnico-científicos, bem como a publicação dos resultados em periódico de renomado conceito.



Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
EUGENIA JACIRA BOLACEL BRAGA2
JAQUELINE DA SILVA DOS SANTOS
KATHARINA ROJAHN WICKBOLDT
MARCELO NOGUEIRA DO AMARAL

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 5.000,00Coordenador

Plano de Aplicação de Despesas

DescriçãoValor
339030 - Material de ConsumoR$ 5.000,00

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