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O referido projeto se trata de uma continuação de um projeto de pesquisa já em andamento, cadastrado no módulo antigo do Cobalto.
De acordo com dados do International Olive Oil Council de 2009, o Brasil foi considerado o sexto maior consumidor de azeite no mundo e terceiro maior importador e está tornando-se um produtor em franca ascensão e com uma previsão de chegar a um milhão de hectares de olivais nos próximos anos, com destaque na Região Sul do Rio Grande do Sul. Com essa produção de azeite em grande escala e em ascendência, espera-se gerar um grande volume de resíduos que serão descartados. Tendo em vista a quantidade de resíduos produzidos (bagaço e folhas) e também estudos já publicados de diferentes plantas com atividade contra microoganismos, optou-se pela utilização dos produtos da oliveira (óleos essenciais, azeite, bagaço e folhas) para obtenção de extratos e/ou óleos essenciais, para os quais, serão pesquisadas e testadas suas atividades antimicrobianas frente a fungos patogênicos e/ou oportunistas na perspectiva de se obter alternativas viáveis e eficientes para uma futura utilização clínica.
A proposta “Olea europaea L.: análise química, citotoxicidade e potencial antifúngico dos diferentes extratos”, ao mesmo tempo em que pesquisa os efeitos e aplicabilidade do complexo azeite e oliveiras, na saúde humana e animal, também avança na perspectiva de um legado de insumos para a agroindústria no que tange a produção de cosmético, fármacos entre outros supracitados. É relevante considerar a formação de recursos humanos no segmento acadêmico, desde programas de graduação (Iniciação Cientifica – IC), de pós-graduação (mestrado/doutorado) e programas de pós-doutorado (PDJ e PNPD).

A metodologia a ser utilizada no projeto proposto consiste em diferentes etapas, desde a coleta da amostra e preparação dos extratos até a execução das diferentes análises relacionadas à composição química, citotoxicidade e atividade antifúngica.
4.1. Locais de Trabalho
• Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Micologia Veterinária (MicVet) da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Capão do Leão, RS.
• Departamento de Clinicas Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Capão do Leão, RS.
• Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Capão do Leão, RS.
• Laboratório de Análise de Azeites - EMBRAPA Clima Temperado, Capão do Leão, RS.
• Depto. de Farmacologia da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS.
• Depto. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial da Faculdade de Agronomia da Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
4.2. Folhas e Frutos
4.2.1. Extração do Azeite
Serão analisados azeites de cinco variedades distintas (arbequina, koroneiki, picual, coratina e frantoio), produzidos na Fazenda Guarda Velha, com localização geográfica (31°30'02"S; 53°30'29"O), no município de Pinheiro Machado/RS. Os azeites serão elaborados utilizando o Sistema ABENCOR® de extração. Nesse sistema é reproduzido o processo de trabalho de uma lagar industrial de azeitonas em pequena escala, sendo possível a preparação de oito amostras simultâneas, obtendo-se amostras de azeite que possibilitem sua utilização para avaliação de suas características físico-químicas. As amostras de frutos são trituradas em moinho de martelos obtendo-se uma pasta que é homogeneizada por um processo de bateção a uma temperatura controlada, em torno de 28⁰C, sendo posteriormente levado a centrifugação a 3.500rpm, onde se obtêm o azeite, que é recolhido juntamente com a água de vegetação, para posterior decantação e separação das mesmas.
4.2.2 Azeites Comerciais
Os azeites comerciais das cultivares arbequina, koroneiki, picual, coratina e frantoio, serão adquirido de distribuidora com certificado de registro e armazenadas em frasco âmbar, protegidos da luz.
4.2.3 Extração dos óleos Essenciais
Serão analisados folhas e frutos (bagaço) de cinco variedades distintas (arbequina, koroneiki, picual, coratina e frantoio), produzidos na Fazenda Guarda Velha, localização geográfica (31°30'02"S; 53°30'29"O), no município de Pinheiro Machado/RS. As folhas secas e o bagaço das plantas serão encaminhadas ao Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Para obtenção do óleo essencial, para isso as folhas secas e o bagaço serão submetidas à extração com arraste de vapor em aparelho Clevenger, segundo a Farmacopéia Brasileira IV, durante 4h. Após a obtenção do óleo, serão dessecados com sulfato de sódio anidro p.a, armazenado em frasco âmbar, e mantido sob refrigeração até a utilização. A análise cromatográfica será realizada em equipamento CG/FID (Schimadzu®, modelo 2010) equipado com uma coluna de sílica DB-5 (30m x 0,25mm x 0,25μm) com temperatura inicial de 40ºC, ocorrendo um aumento na taxa de 2ºC min-1 até atingir 145ºC. A partir dessa temperatura a taxa será de 10ºC min-1 até atingir 280ºC, permanecendo nesta temperatura por 10min; Td = 280ºC; Tinj = 280ºC; Tcol = 40ºC; Split = 1:50. Serão preparadas soluções do óleo a 5.000 mg L-1 em hexano e dos padrões cromatográficos a 40 mg L-1, sendo utilizados os seguintes padrões: α-pineno, canfeno, β-pineno, mirceno, α-terpineno, p-cimeno, limoneno, 1,8-cineol, terpinoleno, linalol, 4-terpineol, α-terpineol, timol e carvacrol. Após, as soluções serão injetadas no cromatógrafo em volume de 1μL, sendo os constituintes presentes nos óleos, identificados por comparação entre o tempo de retenção dos padrões e das amostras.
4.2.4 Extrato Hidroalcoólico
A obtenção do extrato será a partir da concentração da tintura a 10% acrescido de álcool 70º GL, preparados de acordo com Schiedeck et al. (2008). Assim sendo, as plantas em maceração serão mantidas por sete dias, com agitações periódicas. Posteriormente a solução será filtrada, o volume perdido será restituído com álcool 70º e acondicionado em frasco âmbar.
4.2.5 Infusão
A concentração dos extratos aquosos será de 10%, será realizado através de infusão de suas folhas que serão acondicionadas em vasilhame contendo água a 90ºC, permanecendo por 10 minutos a mesma temperatura. Após o tempo determinado, o preparo será filtrado em papel Whatmann nº1, filtro que auxilia na eliminação de resíduos sólidos.
4.2.6 Decocção
Também preparada a concentração de 10%, através do armazenamento das partes aéreas da planta em reservatório contendo água destilada estéril, os quais serão submetidos ao aquecimento até ebulição, mantidos dessa forma durante 10 minutos. Esses preparos também serão filtrados em papel Whatmann nº1, afim de eliminar resíduos sólidos.
4.3 Análise Química dos Extratos
Os constituintes químicos dos extratos hidroalcóolico, decocção e infusão de Olea europaea L. serão analisados a partir da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) e para óleos essenciais realizar-se-á através de Cromatografia Gasosa (CG).
4.4 Isolados Fúngicos
As cepas e isolados fúngicos patogênicos e/ou oportunistas utilizados para avaliação de suscetibilidade in vitro sobre os extratos de Olea europaea L. serão provenientes da Micoteca do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Micologia Veterinária (MicVet), localizada na Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), em Pelotas, RS, Brasil. O estoque de isolados são oriundos de casos clínicos confirmados de dermatofitose, candidose e esporotricose em felinos, bovinos e caninos e humanos.
4.5 Teste de Suscetibilidade in vitro
No teste de sensibilidade, realizar-se-á a partir da técnica de microdiluição em caldo, de acordo com o documento M38-A3 para fungos filamentosos e M27-A2 para fungos leveduriformes do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), com adaptações para produtos químicos (NCCLS,2002). Para preparações de O. europaea L., será testado diluição em dez vezes, sendo elas sucessivas, avaliando as concentrações de 40 a 0,07 mg mL-1. As concentrações supracitadas serão, primeiramente, diluídas em meio RPMI-1640, acrescido de tampão MOPS e solução salina. Os testes serão realizados em triplicata em microplacas plásticas de 96 poços de fundo chato. Nas microplacas, o controle negativo era disposto na coluna de nº 1, já na coluna de nº 12 representava o controle positivo, no intuito de evidenciar a esterilidade do meio de cultura. Nos poços restantes serão colocados 100 μl de inóculo diluído em RPMI-1640 e acrescido 100 μl do produto a ser testado, posteriormente eram incubadas por 96 horas em temperatura de 25ºC até a realização da leitura da Concentração Inibitória Mínima (CIM), que é marcado pela menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico, visualmente. Em seguida, a Concentração Fungicida Mínima (CFM), será avaliada através da semeadura de 10 μl de cada poço em placas de Petri adicionadas de ágar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol. Essas placas serão incubadas por cinco dias a 25ºC para os fungos filamentosos e por 72 horas a 37ºC para os fungos leveduriformes, determinando a menor concentração, na qual, não ocorreu crescimento fúngico.
4.6 Teste de Citotoxicidade in vitro
A partir de células Crandell Rees feline kidney (CRFK) e Madin Darby Canine Kidney Cell (MDCK) cultivadas em RPMI-1640 acrescida de L-glutamina, sem bicarbonato de sódio (pH 7,2) suplementado de penicilina-estreptomicina e fungizona (PSF) em atmosfera controlada com 5% de CO2, úmida e a 37ºC, o efeito citotóxico será estimado a partir do ensaio MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5difeniltetrazólico). Adição de tripsina nas células monocamada, suspensas em RPMI-1640, resultando em suspensão com cerca de 2x105 células mL-1. A transferência de alíquotas da suspensão celular será transferida para poços de microplacas de 96 poços. Essas células serão incubadas juntamente com meio RPMI-1640 acrescido de soro fetal bovino e a 5% de CO2 por 24 horas na temperatura de 37ºC. Posteriormente, 100 μl de cada extrato com suas sucessivas diluições serão acondicionadas às microplacas, sendo essas testadas em triplicata durante 48 hora com atmosfera controlada de 5% de CO2, úmida e a 37ºC.
Sequencialmente, 50 μl da solução MTT a 2,5 mg mL-1 será adicionado nos poços, incubados a 37ºC por 2 hora em atmosfera controlada. Em seguida, a solução MTT será retirada e 50 μl de DMSO (dimetilsufóxido) será acrescentado, para desfazer os cristais de formanzan, e agitados suavemente por 5 minutos. O monitoramento das células será realizado a partir de um microscópio invertido, e os resultados expressos em porcentagem de inibição de acordo com as células controle, esta sendo considerada 100%.

RESULTADOS ESPERADOS
• Durante os primeiros meses de execução do projeto, realizar-se-ão revisões bibliográficas sobre o tema, organização de protocolos, materiais, obtenção de produtos, separação dos isolados, revisão de técnicas que serão utilizadas.
• Determinar a partir de testes in vitro pela técnica de microdiluição em caldo a concentração ideal de uso, além de identificar os componentes químicos dos extratos e avaliar sua atividade citotóxica.
• Demostrar o potencial antimicrobiano de diversos extratos obtidos a partir da folha, do bagaço, do óleo essencial e azeite da oliveira (Olea europaea L.) podem ser opções terapêuticas no tratamento de doenças fúngicas.
• Viabilizar um fitoterápico capaz de inibir e/ou eliminar doenças fúngicas, identificando os principais componentes dos extratos, os quais se mostrarem mais eficazes nos testes fungicidas e fungistáticos, em concomitância com a citotoxicidade do mesmo.
Com os resultados obtidos, daremos continuidade a estudos preliminares já realizados pelo Grupo de Pesquisa em Micologia, registrado no CNPq e credenciado na UFPel. Esses dados obtidos serão publicados em eventos científicos e em forma de papers indexados e qualificados, no sentido de propagar e/ou divulgar o conhecimento científico alcançado junto às comunidades locais, nacionais e internacionais. Ao finalizar o projeto, o resultado esperado quanto à formação de recursos humanos, serão traduzidos através da qualificação de alunos da graduação (IC) e da pós-graduação (mestrado/doutorado).