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As mudanças climáticas globais, sejam elas causadas por fatores antrópicos ou naturais, são muito estudadas na atualidade devido sua interferência na vida terrestre. Dentre as mudanças mais estudas estão as de temperaturas e a alta taxa de emissão de gases causadores do efeito estufa, dentre eles o dióxido de carbono. A elevação dos níveis de CO2 atmosféricos foram exponenciais após a revolução industrial, contudo os piores cenários de emissões globais de carbono estão sendo exibidos nos últimos anos (Jackson et al., 2017). Atualmente a concentração de CO2 atmosférico é aproximadamente 400 ppm, mais especificamente 417,1 ppm, registrados no mês de julho deste ano no observatório de Observatório Mauna Loa – EUA. Em 2005, um estudo realizado por Ainsworth e colaboradores projetava no mínimo uma duplicação dos níveis de CO2 até o ano de 2100, saindo dos patamares de 400 ppm e chegando aos 800 ppm de CO2 na atmosfera.
A fotossíntese é a principal forma de reciclagem do carbono terrestre, independente do metabolismo bioquímico utilizado para fixação de carbono (C3, C4 ou CAM). Porém altas concentrações de carbono atmosférico ocasionam mudanças morfológicas e fisiológicas nas plantas (Canadell et al., 2007; Tans et al., 2016). Plantas que apresentam metabolismo C3 são mais responsivas a altas concentrações de CO2 atmosférico, aumentando sua biomassa, em relação a plantas que possuem metabolismo C4, (Ainsworth et al., 2002; Bernacchi et al., 2006; Kimball 2016). O aumento da biomassa em espécies C3 expostas ao elevado CO2 atmosférico muitas vezes se reflete em maior produtividade. Entretanto este crescimento para algumas espécies de plantas C3 é responsivo até um limite de aproximadamente 1000 ppm de CO2 (Canadell et al., 2007; Drag et al., 2020).
Além do acréscimo de biomassa em plantas C3, estar diretamente atrelado ao aumento do CO2 atmosférico apenas até certo platô, este crescimento muitas vezes é limitado por outros fatores como disponibilidade hídrica e nutricional, principalmente nitrogênio (Ma et al., 2007; Wang, et al., 2012; Parvin et al., 2018). Entretanto muitas espécies C3 possuem a capacidade de realizar simbiose com bactérias diazotróficas, sendo assim capazes de minimizar os efeitos de deficiência de nitrogênio, maximizando os benefícios do elevado CO2 (Rogers et al., 2009; Kant et al., 2012). Em elevadas concentrações de CO2, as plantas aumentam o fornecimento de açúcares para as bactérias localizadas nos nódulos. Assim, há aumento da fixação de nitrogênio pelas bactérias simbiontes (Lam et al., 2012; Li et al., 2017).
Mesmo plantas em simbiose com bactérias fixadoras de N2 podem ter sua produtividade fortemente limitada por nutrientes, normalmente pela baixa disponibilidade de P, K, Mg e Mo no solo (Hungate et al., 2004, Reich et al., 2006, van Groenigen et al., 2006, Rogers et al., 2009 ). Na atual tentativa de elevar a produtividade de culturas leguminosas utilizadas para alimentação humana e animal, práticas de coinoculação com bactérias diazotróficas, como do gênero Bradyrhizobium e Azospirillum, demostram melhorar a aquisição de nutrientes pelas plantas. Essa melhor absorção de nutrientes ocorre devido ao aumento da área de absorção do sistema radicular e a maior fixação de nitrogênio causado por essas bactérias agindo em simbiose com a planta (Moretti et al., 2020).
Além das bactérias promotoras do crescimento de plantas, fungos micorrízicos arbusculares (FMA) como o Rhizophagus intraradices, também melhoram o desempenho reprodutivo das plantas. Os FMA são conhecidos por aumentarem a absorção de nutrientes pelas plantas, principalmente fósforo e nitrogênio, bem como por promover um melhor desenvolvimento radicular (Musyoka et al. 2020; Vergara et al. 2019). Os FMA também são responsáveis por uma grande mobilização de carbono no solo. Quando os níveis de CO2 são elevados, a comunidade microbiana de forma geral também aumenta (Jílková et al., 2020).
Em plantas sob condições de normoxia, o aumento do número de nódulos, massa de nódulos, fixação de N2 por unidade de massa e antecipação da nodulação são comuns em plantas expostas a elevados níveis de CO2 atmosférico, assim como em plantas coinoculadas com mais de uma bactéria diazotrófica (Rogers et al., 2009; Li et al., 2017; Fukami., 2018; Moretti et al., 2020; Palit et al., 2020; Rondina et al., 2020). No entanto, em condições de baixas concentrações de oxigênio (hipóxia) não é conhecido como as altas concentrações de CO2 e a coinoculação com bactérias diazotróficas e FMA podem afetar o metabolismo vegetal. No mundo cerca de 17 milhões de Km² estão sujeitos a eventos de alagamento. Plantas sujeitas a condições de alagamento apresentam alterações metabólicas decorrentes da baixa disponibilidade de oxigênio para as raízes (Voesenek et al 2013). Durante a hipóxia, ocorre redução da fixação biológica de nitrogênio e das taxas fotossintéticas, resultando em menor produção de carboidratos e açúcares. Essas reduções culminam com a redução da biomassa vegetal (Van dongen et al., 2015; Garcia et al., 2020). Desta forma, o presente projeto tem por objetivo elucidar adaptações no metabolismo do carbono e nitrogênio em plantas de soja coinoculadas com Bradyrhizobium elkanii, Azospirillum brasilense e Rhizophagus intraradices submetidas a condições de alagamento em ambientes enriquecidos com CO2.

Material vegetal e condições de crescimento

Sementes de soja [Glycine max (L.) Merril] de cultivar sensível ao alagamento (PELBR 7060) serão inoculadas com bactérias diazotróficas e fungos micorrízicos arbusculares (Quadro 1). As sementes serão colocadas para germinar e cultivadas em vasos de três litros contendo solo (devidamente esterilizado e com correção de adubação e calagem conforme análise prévia). Quando as plantas atingirem o estágio fenológico V5 (Fehr et al., 1971), serão alagadas por sete dias. Após esse período, serão realizadas coletas para análise de parâmetros metabólicos e biométricos.
No primeiro experimento as sementes serão coinoculadas com Bradyrhizobium, Azospirillum e Rhizophagus, no segundo experimento as sementes serão coinoculadas com o tratamento que apresentar destaque nas avaliações realizadas no primeiro. Em ambos os experimentos as plantas serão submetidas ao alagamento por sete dias, entretanto no segundo experimento haverá uma coleta de recuperação com três dias após o alagamento. Plantas apenas inoculadas com Bradyrhizobium serão consideradas como tratamento controle para o fator microrganismo, já para o fator CO2, o ambiente com CO2 na concentração de 400 µmol mol-1 será considerado controle sendo então 800 µmol mol-1 o tratamento de elevado CO2. Um terceiro experimento será conduzido para que seja possível avaliar os parâmetros biométricos e de rendimento da cultura.
Afim de pré-selecionar a melhor forma de coinoculação nas condições testadas, no primeiro experimento serão avaliadas variáveis relacionadas à taxa fotossintética, concentração de pigmentos fotossintéticos foliares, teores de carboidratos solúveis, concentração de amido, sacarose, concentração de aminoácidos, concentração de ureídeos totais, composição mineral, teor de proteína total, espécies reativas de oxigênio, atividade de enzimas antioxidantes. Já no segundo experimento, serão realizadas as análises de atividade das enzimas glutamina sintetase e glutamato sintase, caracterização específica de aminoácidos e ureídeos, ácidos orgânicos, oxido nítrico, atividade da enzima sacarose sintase e das enzimas do metabolismo fermentativo, bem como as análises realizadas no primeiro experimento, com intuito de explicar o como e porque a referida coinoculação altera o metabolismo de plantas sob alagamento em condições de níveis elevados de CO2.

Quadro 1: Tratamentos pretendidos para realização do experimento.
Tratamento Nível de CO2 Condição Hídrica Tratamento Biológico
Experimento 1
T1 400 µmol mol-1 Controle Bradyrhizobium elkanii
T2 Bradyrhizobium elkanii e Azospirillum brasilense
T3 Bradyrhizobium elkanii e Rhizophagus intraradices
T4 Bradyrhizobium elkanii, Azospirillum brasilense e Rhizophagus intraradices
T5 400 µmol mol-1 Alagamento Bradyrhizobium elkanii
T6 Bradyrhizobium elkanii e Azospirillum brasilense
T7 Bradyrhizobium elkanii e Rhizophagus intraradices
T8 Bradyrhizobium elkanii, Azospirillum brasilense e Rhizophagus intraradices
T9 800 µmol mol-1 Controle Bradyrhizobium elkanii
T10 Bradyrhizobium elkanii e Azospirillum brasilense
T11 Bradyrhizobium elkanii e Rhizophagus intraradices
T12 Bradyrhizobium elkanii, Azospirillum brasilense e Rhizophagus intraradices
T13 800 µmol mol-1 Alagamento Bradyrhizobium elkanii
T14 Bradyrhizobium elkanii e Azospirillum brasilense
T15 Bradyrhizobium elkanii e Rhizophagus intraradices
T16 Bradyrhizobium elkanii, Azospirillum brasilense e Rhizophagus intraradices

Métodos Analíticos

Trocas Gasosas Foliares
As trocas gasosas foliares serão medidas utilizado um analisador portátil de gases por infravermelho (IRGA).

Extração e Quantificação de Pigmentos Fotossintéticos
As determinações dos pigmentos fotossintéticos serão realizadas conforme método de Wellburn (1994).

Extração e dosagem da atividade das Enzimas Antioxidantes
Amostras de folhas, raízes e nódulos serão coletadas para análises da atividade da superóxido dismutase (SOD: EC 1.15.1.1) (Giannopolitis; Ries 1977), catalase (CAT: EC 1.11.1.6) (AZEVEDO NETO et al. 2006) e ascorbato peroxidase (APX: EC 1.11.1.11) (Nakano e Asada 1981). O teor de proteínas será determinado de acordo com Bradford (1976).

Conteúdo de Ascorbato e Dehidroascorbato
Ascorbato e dehidroascorbato serão determinados em amostras de raízes, nódulos e folhas, conforme descrito por Arakawa et al. (1981).
4.2.5 Quantificação dos Teores de Espécies Reativas de Oxigênio e Peroxidação Lipídica
Os teores de H2O2 em nódulos, raízes e folhas serão determinados de acordo com metodologia proposta por Velikova et al. (2000). A peroxidação lipídica será determinada conforme método descrito por Cakmak e Horst (1991). Os teores de superóxido em nódulos, raízes e folhas serão determinados de acordo com Li et al. (2010).

Extração e Determinação da Atividade das Enzimas Fermentativas
Amostras de raízes e nódulos serão utilizadas para determinação da atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1), piruvato descarboxilase (EC 4.1.1.17), lactato desidrogenase (EC 1.1.1.17), conforme método de HANSON et al. (1984). A atividade da alanina aminotransferase (EC 2.6.1.2) será determinada conforme metodologia de Sousa et al. (2003).

Conteúdo de Metabólitos Anaeróbicos
Os metabólitos etanol, lactato e piruvato de raízes e nódulos serão determinados por meio de kits, conforme recomendações do fabricante (Boehringer, Mannheim, Germany).

Conteúdo de Carboidratos
Os extratos para dosagem de açúcares solúveis totais (AST) e sacarose em raízes, nódulos e folhas serão obtidos conforme metodologia de Bieleski e Turner (1966) com modificações. A determinação de polissacarídeos solúveis em água será realizada conforme McCready et al. (1950). A dosagem de AST será realizada com base em Graham e Smydzuk (1965) e a dosagem de sacarose será determinada de acordo com Handel (1968).
Coleta de Seiva de Xilema e Floema
A coleta de seiva do xilema e floema será realizada conforme McClure (1979) para análises de ureídeos, aminoácidos e açúcares solúveis. A separação e análise de aminoácidos serão conduzidas com base no sistema OPA (o-ftaldialdeídeo) (Jarrett et al., 1986)

Dosagem de Ureídeos Totais
Os teores dos ureídeos totais, alantoína e ácido alantóico serão determinados em folhas, seiva de xilema, raízes e nódulos, conforme metodologia de VOGELS; VAN DER DRIFT (1970).

Dosagem de Aminoácidos Totais
A dosagem de aminoácidos solúveis totais em raízes, nódulos, folhas e exsudatos do xilema será realizada através do método de Yemm e Coocking (1955). A separação e análise de aminoácidos será realizada com base no sistema OPA (o-ftaldialdeídeo) (Jarrett et al., 1986)

Extração e Dosagem da Enzima Glutamina Sintetase (GS: E.C.6.6.1.2)
A extração proteica para determinação da atividade da GS será realizada em raízes, nódulos e folhas conforme metodologia proposta por Cullimore et al. (1983). A atividade da enzima será dosada conforme metodologia proposta por Cullimore et al. (1982).

Extração e Dosagem da Enzima Glutamato Sintase dependente de NADH (NADH-GOGAT: EC1.4.1.1.14) e dependente de Ferredoxina (Fd-GOGAT: EC 1.4.7.1.)
A extração proteica e a determinação da atividade da NADH-GOGAT em nódulos, raízes e folhas será realizada conforme descrito na metodologia de Chen; Cullimore (1988).

Determinação do N-total
A determinação de nitrogênio total em raízes, folhas e nódulos será realizada pelo método descrito por Nelson; Sommers (1973).

Determinação de Óxido Nítrico
A quantificação de óxido nítrico será realizada em nódulos, e raízes conforme metodologia proposta por da Silva e do Amarante (2020).

Determinação de metabólitos do ciclo dos ácidos tricarboxilicos
Os metabólitos do ciclo dos ácidos tricarboxílicos serão determinados em folhas, seiva de xilema, raízes e nódulos conforme metodologia descrita por Puiatti et al. (1999).

Extração e dosagem da enzima Sacarose sintase
A extração proteica para determinação da atividade enzimática será realizada em raízes, nódulos e folhas conforme adaptação na metodologia de (Zrenner et al., 1995,); (Geigenberger e Stitt, 1993.).

A avaliação da atividade da enzima nitrogenase em nódulos será realizada segundo metodologia proposta por Holsten et al. (1973).

Análises biométricas
No terceiro experimento pretende-se avaliar as seguintes características de crescimento das plantas: Volume do sistema radicular e de nódulos, massa fresca e seca de raiz, folhas, caules e nódulos; diâmetro de caule; estatura das plantas, estimativa de área foliar; contagem do número de nódulos por planta. Serão avaliados também os componentes de rendimento da soja: Número de nós por planta, número de vagens por planta, número de grãos por vagem e peso de grãos.

Análise Estatística
O experimento será realizado em um delineamento de blocos, com unidade experimental constituída de um vaso contendo duas plantas e quatro repetições por tratamento. Os dados serão submetidos a análise de variância (ANOVA). Quando o teste de diferença da ANOVA, F, for significativo, as médias serão comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro (p ≤ 0,05). As análises estatísticas serão realizadas por meio do programa estatístico SAS 8.0 – Statistical Software Program (SAS Institute Inc. Cary, NC, USA).

Espera-se que as plantas aumentem a fixação de nitrogênio quando cultivadas com maiores níveis de CO2 atmosféricos mesmo sob estresse por alagamento, resultando assim em um aumento da tolerância das plantas ao estresse hipóxico e pós-hipóxico.

Ainda se espera que com o aumento dos níveis de CO2 a planta aumente a sua biomassa, bem como o fornecimento de maior quantidade de açúcares e estruturas carbônicas para sustentar maior nodulação favorecendo a simbiose com os microrganismos inoculados.

De acordo com a severidade do estresse poderá ocorrer uma readequação dos metabólitos de troca entre as bactérias e fungos com a planta com a finalidade de manter a simbiose.

Almeja-se determinar qual a combinação de microrganismos para plantas de soja sujeitas ao estresse por alagamento em ambientes com altos níveis de CO2 impactando positivamente não apenas o rendimento da cultura em condições adversas (alagamento) mas também melhorando a entrada de nitrogênio fixado simbioticamente no sistema, devido à coinoculação e maior disponibilidade de CO2 para a fotossíntese.