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Embora o CaOH2 e o MTA tem sido amplamente utilizado para o capeamento pulpar, esses materiais apresentam limitações. Diante disso, o desenvolvimento de novos materiais com características bioativas é importante. A incorporação de metformina de forma controlada nos permite utiliza-la como agente de síntese mineral e indução de formação de dentina sem que haja um processo de necrose celular seguida de inflamação e reparo como ocorre com os materiais atualmente disponíveis no mercado (CaOH2 e MTA). Assim, o desenho do estudo é inovador e pode trazer novas perspectivas para o desenvolvimento de diferentes materiais odontológicos.
Ademais, e importante pontuar que a indústria nacional poderá ter o domínio de uma plataforma tecnológica inovadora, com várias possibilidades de aplicação, sem depender de tecnologia externa. Esta preocupação foi previamente discutida e dialogada juntamente com a empresa Yller. A proposta desse novo biomaterial é compatível com as necessidades básicas da população, visto que temos uma grande incidência de casos de infecções cariosas, com diferentes graus de severidade e resistência antimicrobiana, que muitas vezes compromete o sucesso do tratamento. Partindo deste princípio, a proposta deste projeto foi buscar uma nova alternativa tecnológica para a resolução dos casos de lesões profundas ou recorrentes de cárie e restaurações que requerem um material bioativo com potencial de regeneração dentinária.

3. Materiais e Métodos:
Para facilitar o entendimento e entendimento do fluxo de desenvolvimento do projeto, descrevemos nesta secção o desenho experimental do projeto.
3.1 Desenho experimental:
Primeiramente nanofibras contendo metformina serão eletrofiadas, em seguida essas fibras serão moídas através de um processo de congelamento e quebra obtendo-se um pó com estruturas nanométricas contendo metformina. Subsequentemente, um hidrogel de gelatina funcionalizado com um grupamento metacrílico (GelMA) será formulado e o pó nano particulado será adicionado ao GelMA em diferentes concentrações. Esse conjunto GelMA + nanofibras será avaliado quanto as propriedades físico-químicas, o que envolve morfologia, taxa de degradação, liberação de fármaco, módulo de elasticidade, resistência a compressão e reologia. As células DPSCs serão expostas ao hidrogel para avaliação da viabilidade, proliferação e migração celular, bem como deposição de matriz mineralizada,
3.2. Fabricação das nanofibras:
Poli (DL-lactido-co-glicólido) -PLGA 75:25, será dissolvido em clorofórmio para obter uma solução de PLGA a 18%. Em outro frasco, metformina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dissolvidos em Metanol (Fischer) a 15% de peso com base no peso de PLGA. Depois de essas soluções estarem completamente dissolvidas, a solução de metiformina será adicionada a solução de PLGA. A nova solução será agitada em uma placa de aquecimento a 60 rpm por 24 horas. A solução resultante será transferida para uma seringa de plástico de 5 ml tampada com uma agulha metálica de calibre 27 (Small Parts, Inc., Miami, FL). As soluções serão espinadas a 1-2 mL / h, a uma distância de 20 cm e com uma voltagem de18 kV em um mandril giratório de aço inoxidável aterrado coberto com folha de alumínio. Após o processamento, as fibras serão secas durante a noite à temperatura ambiente para remover qualquer solvente residual e armazenadas no refrigerador (4 ° C) até serem utilizadas.
A morfologia das fibras eletrofiadas será caracterizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Será utilizada espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) no modo de reflexão total atenuada (ATR) para distinguir a estrutura química e a composição de fase das diferentes nanofibras.
3.3. Síntese de partículas de nanofibras carregadas com drogas
A hidrofilicidade das fibras é uma propriedade importante para se obter uma mistura homogênea em um hidrogel. Para superar este problema, as nanofibras eletrofiadas serão misturadas com GelMA e cromiladas para obter um pó fino de tamanho mícron. Resumidamente, nanofibras eletrofiadas serão cortadas em pequenos pedaços e completamente embebidos em GelMA e este conjunto será foto polimerizado por 60 segundos com uma luz de polimerização de LED de polywave (Bluephase - Ivoclar Vivadent). Após a polimerização, a mistura será colocada em uma capela de fluxo durante a noite para secagem do conjunto. Após a secagem, a mistura de GelMA / fibra submetida a eletrofiação será submetida à crio-moagem para produzir uma estrutura de grão mais fina. As partículas finas obtidas serão armazenadas em um dessecador cheio de sílica em temperatura ambiente até posterior investigação.
3.4. Encapsulamento das partículas de nanofibras no GelMA
Diferentes concentrações das partículas de nanofibras serão peneiradas e homogeneamente dispersas em 4 mL de solução de hidrogel (15% GelMA). será adicionado 0,05% de LAP (Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio) a 50 ° C em condições de agitação (240 rpm). Em seguida, 100 μL da mistura serão colocados em um molde de silicone (CutterSil Putty PLUS, Kulzer LLC, South Bend, IN, EUA) e irradiados por 15 s com uma luz de polimerização de LED polywave (Bluephase, Ivoclar-Vivadent, Amherst, NY, EUA) a 385 nm. Uma solução de GelMA sem as nanofibras será utilizado como controle.
3.5. Sorção e degradação
Para o teste de sorção, os hidrogéis serão preparadas conforme descrito acima em moldes cilíndricos. As amostras (n = 3 / grupo) serão transferidas para PBS para permitir o inchaço a 37 ° C por 24 horas. Após o inchaço, as amostras de hidrogel serão pesadas para determinar seu peso úmido, liofilizadas e pesadas novamente para determinar seu peso seco. As mudanças no peso do hidrogel entre os estados de intumescimento úmido (Ww) e seco (Wd) serão usadas para determinar a razão de intumescimento volumétrico pela seguinte equação:
Taxa de expansão (%) = (Ww - Wd) / Wd × 100.
será realizado um estudo de biodegradação in vitro para o hidrogel na presença de colagenase tipo I (1U / mL). Hidrogéis de forma cilíndrica com as dimensões descritas acima (n = 4 / grupo) serão pesados (Wo) e incubados em 5mL de DPBS a 37 ° C durante 3 semanas. Em pontos de tempo predeterminados, os hidrogéis foram removidos da solução de colagenase e lavados (2x) com água destilada estéril, secos com papel absorvente de baixo teor de fiapos e pesados (peso). Para manter a atividade enzimática constante, as soluções de colagenase serão substituídas por outras novas a cada 3 dias. A taxa de degradação do hidrogel será calculada usando a seguinte equação: Taxa de degradação (%) = W_t / W_o × 100
(onde Wt é o peso úmido residual em pontos de tempo diferentes e W0 é o peso úmido inicial).
3.6. Ensaio de Viabilidade Celular
Para examinar se a modificação do hidrogel GelMA com fibras eletrofiadas com antibióticos levarão à toxicidade celular, as amostras de hidrogel serão preparadas para um ensaio in vitro de acordo com as Diretrizes da ISO10993-5: Testes de Citotoxicidade - Métodos In Vitro. Para esse fim, o amostras (n = 5 / grupo) serão primeiro esterilizadas com UV por 30 min em cada lado, em seguida, serão colocados individualmente em frascos de vidro estéreis contendo 5 mL de α-MEM suplementado com 10% de FBS, L-glutamina, 1% de penicilina streptomicina e 1U / mL de colagenase tipo I. Em seguida, as amostras serão incubadas a 37 ° C em tempo predeterminado durante 28 dias. Alíquotas de 500 μL serão coletadas para determinar a citotoxicidade ao longo do tempo. Após as coletas os extratos serão filtrados através de uma membrana de 0,22 μm antes da exposição celular.
Células-tronco da polpa dentaria (DPSCs), serão cultivadas em uma incubadora a 37 ° C, com 5% de CO2 em α-MEM suplementado com 10% de FBS, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina. DPSCs serão semeadas a uma densidade de 2,5x103 células por poço e deixados aderir aos poços de 96 poços pratos. Após 24 h, o meio será substituído pelos extratos coletados (100 μL) dos hidrogéis e mantidos em contato com as células por 24 h. Posteriormente, serão adicionados 20 μL de reagente de solução CellTiter 96 AQueous One aos poços de teste que ficarão em contato com as células por 2 h a 37 ° C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. Logo após será feita a leitura da absorbância a 490 nm (SpectraMax iD3, Molecular Devices, LLC, San Jose, CA, EUA). DPSCs cultivados em α-MEM completo sem adição dos extratos serão usados como controle positivo. Os valores de absorbância serão convertidos para porcentagem comparando-se o crescimento celular sem adição de extratos com os valores obtidos para os grupos de teste.
3.7. Proliferação celular
Amostras de hidrogel (6 mm de diâmetro x 2 mm de espessura) serão preparadas para e depois desinfetado por luz UV (30 min de cada lado). DPSCs serão semeados a uma densidade de 5 × 103 células / poço em placas de 24 poços. As amostras esterilizadas serão colocadas em inserções transwell de plástico estéril (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA, EUA) para investigar o efeito da liberação de metformina na proliferação celular usando o ensaio AlamarBlue (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) em 1, 3 e 5 dias.
Para esta analise, nos dias predeterminados, 10% do reagente de ensaio será adicionado a 90% da quantidade de meio existente em cada poço onde ficara agindo por 2 h a 37 ° C e 5% de CO2. Após este período, a proliferação será avaliada através da leitura do corante incorporado usando um leitor de placa baseado em fluorescência. Após a leitura, as células serão lavadas com PBS e meio de cultura fresco será adicionado aos poços.
3.8. Interação célula / scaffold
Amostras de hidrogel (6 mm de diâmetro x 2 mm de espessura) serão preparadas e desinfetadas por luz UV (30 min de cada lado) e colocadas em placas de 24 poços. DPSCs serão semeados na superfície das amostras de hidrogel a uma densidade de 5 × 103 células por poço e cultivadas por 1, 3 e 5 dias. Após este período, o meio será aspirado e os hidrogéis serão lavados suavemente em PBS. As células serão estão fixados em 4% PFA por 48 h e levadas pra analise em microscopia eletrônica de varredura (MEV) de baixo vácuo para obtenção das imagens de MEV.
3.9. Ensaios de diferenciação odontogênica
Amostras de hidrogel (6 mm de diâmetro x 2 mm de espessura) serão preparadas e desinfetadas por luz UV (30 min de cada lado). DPSCs confluentes na passagem 4 serão colhidos para semeadas a uma densidade de 3 × 104 células / poço para diferenciação odontogênica (atividade de fosfatase alcalina, ALP e coloração com vermelho de alizarina, ARS).

E esperado neste estudo obter scaffolds injetáveis de liberação de fármaco sob demanda, contendo metformina, para induzir o processo de dentinogênese. Sendo assim, as metas deste projeto sao:
1. eletrofiar nanofibras contendo metformina
2. Moer estas nanofibras através de um processo de congelamento e quebra obtendo-se um pó com estruturas nanométricas contendo metformina.
3. formular um hidrogel de gelatina funcionalizado com um grupamento metacrílico (GelMA)
4. Adicionar ao hidrogel o pó nano particulado em diferentes concentrações
5. Testar esse conjunto GelMA + nanofibras quanto as propriedades físico-químicas, o que envolve morfologia, taxa de degradação, liberação de fármaco, módulo de elasticidade, resistência a compressão e reologia. As células DPSCs serão expostas ao hidrogel para avaliação da viabilidade, proliferação e migração celular, bem como deposição de matriz mineralizada.
Obtendo-se assim, a concentração que gera mais deposição de matriz mineralizada (reparo dentinario).