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Atualmente, estima-se que 50 milhões de pessoas no mundo sejam acometidas por algum tipo de demência, sendo a Doença de Alzheimer (DA), a causa mais comum de demência em idosos. A DA é uma condição neurológica progressiva e irreversível, caracterizada por perda cognitiva, bem como perda da função ou morte de células neuronais. Ainda, apresenta como principais características fisiopatológicas a deposição do peptídeo β-amilóide (βA), emaranhados neurofibrilares e déficit colinérgico. Além disso, a resistência à insulina cerebral tem sido associada com a DA devido à mecanismos como deficiência no metabolismo da glicose, aumento de estresse oxidativo e processos inflamatórios. Sendo assim, trabalhos avaliando o potencial farmacológico de antidiabéticos para o tratamento da DA tem sido foco de estudos nos últimos anos.
Entretanto, cabe ressaltar que os fármacos disponíveis atualmente para o tratamento da DA apenas amenizam os sintomas da doença, e na maioria das vezes retardam o déficit cognitivo e funcional dos pacientes acometidos pela DA. Apesar da intensa pesquisa gerada nos últimos anos, ainda há uma compreensão limitada e inconclusiva da etiologia e fisiopatologia dessa doença, havendo assim, a necessidade da busca por novas alternativas farmacológicas para o tratamento da DA.
Neste contexto, os produtos naturais ricos em antocianinas têm demonstrado atividade neuroprotetora em diversas doenças que afetam o sistema nervoso central (SNC). Uma atenção especial é dada ao Rubus sp., fruto conhecido como amora preta por apresentar atividade antioxidante já comprovada devido aos compostos fenólicos presentes em sua estrutura. Este fruto apresenta majoritariamente a antocianina cianidina-3-glicosídeo em sua composição, a qual já foi relatada a atividade terapêutica na Doença de Parkinson, isquemia cerebral e esclerose múltipla. Sendo assim, o objetivo deste trabalho é avaliar o potencial neuroprotetor do extrato de Rubus sp. em modelos pré-clínicos para a DA.

METODOLOGIA

OBTENÇÃO DO EXTRATO DE AMORA PRETA

Os frutos de Rubus sp. serão disponibilizados pela Embrapa Clima Temperado (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária), Pelotas/RS. Para a obtenção dos extratos metanólicos, será utilizado o método padronizado por Chaves et al. (2018).

PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE DA INDUZIDO POR ESCOPOLAMINA (SCO)

Modelo de déficit de memória induzido por SCO e tratamento com extrato de amora e donepezil

Serão utilizados ratos machos que serão divididos em cinco grupos (n=10): I – Controle; II – SCO; III – SCO + extrato de amora (100 mg/kg); IV – SCO + extrato de amora (200 mg/kg); V – SCO + donepezil (5 mg/kg). Primeiramente os animais serão pré-tratados durante 10 dias com extrato de amora (100 ou 200 mg/kg) ou donepezil (5mg/kg) uma vez ao dia por via intragástrica. As doses e vias de administração foram baseadas em trabalhos prévios da literatura (CHAVES et al., 2018; PACHECO et al., 2018; HOANGA et al., 2020). No 9º dia será realizado a avaliação da atividade locomotora dos animais através do campo aberto e o treino do reconhecimento de objetos e após os animais receberão SCO (1mg/kg) via intraperitoneal. Após 24 horas da administração de SCO (10º dia) será realizado o teste do reconhecimento de objetos seguido da eutanásia dos animais.


PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE DA INDUZIDO POR ESTREPTOZOTOCINA (STZ)

Modelo de déficit de memória induzido por STZ e tratamento com extrato de amora e metformina

Serão utilizados ratos machos que serão divididos em cinco grupos (n=10): I – Controle; II – STZ; III – STZ + extrato de amora (100 mg/kg); IV – STZ + extrato de amora (200 mg/kg); V – STZ + metformina (150 mg/kg). Primeiramente os animais serão anestesiados via intraperitoneal com cetamina e xilazina. Após os animais serão posicionados em um aparato estereotáxico, sendo realizada uma incisão na linha média sagital da cabeça. O crânio será perfurado em ambos os lados de acordo com as coordenadas estereotáxicas para os ventrículos laterais. As coordenadas serão 0,8 mm anteroposterior, 1,5 mm lateral relativo ao bregma, 4,0 mm dorsoventral relativo à dura-máter com agulha fixada em 0 mm (PAXINOS e WATSON, 1986). Os animais dos grupos II, III, IV e V receberão injeção intracerebroventricular bilateral de STZ (3 mg/kg) diluído em tampão citrato (pH 4,5), colocando-se o volume de 5 µL em cada ventrículo através de uma seringa de 28-gauge Hamilton® de 10 µL anexada ao aparato estereotáxico. Os animais do grupo I passarão pelo mesmo procedimento, entretanto, receberão 5 µL de tampão citrato. Ao término deste procedimento, a pele em conjunto com o restante do tecido subcutâneo será suturada com fio de náilon agulhado. O protocolo experimental terá duração de 29 dias sendo que os testes comportamentais para a avaliação da memória ocorrerão em duas etapas. No 6°, 7°e 8° dias após a injeção de STZ será realizado os testes de campo aberto e o de reconhecimento de objetos. No 8° dia será iniciado o tratamento por via intragástrica de extrato de Rubus sp. (100 e 200 mg/kg) ou de metformina (150 mg/kg) durante 21 dias. As doses e vias de administração foram baseadas em trabalhos prévios da literatura (CHAVES et al., 2018; KESHAVARZI et al., 2019). No 27°, 28°, 29° após a injeção de STZ e, portanto, no período final dos tratamentos, os animais serão novamente submetidos a testes comportamentais como campo aberto, reconhecimento de objetos e teste do labirinto Y com o objetivo de avaliar se os tratamentos foram capazes de reverter os déficits de memória induzidos pelo STZ. Após os testes comportamentais os animais serão submetidos a eutanásia e estruturas cerebrais e liquor serão coletados para posteriores análises.

AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS

Teste do campo aberto
O teste do campo aberto será realizado para a avaliação da atividade exploratória e locomotora dos animais. Para isto, é utilizado um aparato quadrado (56 x 40 x 30 cm), sendo o fundo da caixa divido em 12 quadrantes (12 x 12 cm). Para a execução do teste, os animais serão colocados individualmente em um dos quatro cantos da caixa, permanecendo durante 5 min, e serão registrados a frequência de cruzamento nos quadrantes centrais e periféricos, rearings e groomings (GUTIERRES et al., 2012).
Teste do reconhecimento de objetos
O teste de reconhecimento de objetos será realizado 24h após a realização do teste do campo aberto, no qual ambos os testes serão realizados no mesmo aparato. Nesse teste, os animais serão colocados individualmente no aparato com dois objetos idênticos (objetos A1 e A2) de mesmo formato e de mesma cor, durante 5 minutos, a fim de que os animais possam explorá-los livremente (treino). Após 3 horas, o teste é realizado novamente, sendo substituído um dos objetos para outro (objeto B) com novo formato e cor diferente dos objetos iniciais (A1 e A2), para avaliar a memória de curto prazo, durante a exploração dos objetos por 5 min (teste). Este teste também será realizado 24h depois do treino, para avaliar a memória de longo prazo. Os objetos a serem utilizados na tarefa serão de plástico e ficarão dispostos numa posição simétrica dentro do aparato. Tanto o aparato quanto os objetos serão limpos entre cada sessão de treino ou teste com etanol 40% para remover os resíduos e odor. Será considerada a exploração do objeto, apenas quando o animal cheirar ou tocar os objetos com o focinho e/ou com as patas dianteiras. Os resultados serão expressos através do índice de reconhecimento para cada animal, calculado através da razão TB/(TA+TB), nos quais: TA = tempo de exploração do objeto familiar A e TB = tempo de exploração do objeto novo B (DA SILVA et al., 2007).

Teste do labirinto em Y
O teste do labirinto em Y será realizado com o objetivo de avaliar a aprendizagem e a memória espacial dos animais. Neste teste é utilizado um labirinto composto por três braços de tamanhos iguais: braço inicial (A), braço novo (B) e braço outro (C). O teste consiste numa sessão de treino na qual um dos braços do aparato é bloqueado, sendo assim, o animal é colocado no braço inicial do aparato (A), podendo explorar livremente os braços A e C, por 5 min. Após 3h, o braço novo será aberto e o animal poderá explorar livremente os três braços durante 5 min. durante 5 minutos. O aparato será limpo com etanol 40% após cada sessão individual de treino ou teste. O tempo gasto em cada braço será determinado e os resultados serão expressos como tempo gasto no braço novo e número de entradas no braço novo (COGNATO et al., 2010).

PREPARO DAS AMOSTRAS

Após a eutanásia, o cérebro dos animais será retirado e dissecado em córtex cerebral, hipocampo e cerebelo os quais serão armazenados à – 80°C até as análises bioquímicas. Para a análise dos parâmetros de estresse oxidativo, as estruturas cerebrais serão homogeneizados em tampão fosfato de sódio pH 7,4 contendo KCl (1:10). Os homogenizados serão centrifugados a 3500 rpm durante 10 min a 4°C. Aquelas amostras que passarem pela análise da AChE serão homogeneizadas em tampão Tris HCl 10 mM pH 7,4, aos quais serão levados à centrifugação a 1800 rpm por 10 min. Após a centrifugação, os pellets serão descartados e os sobrenadantes separados para as avaliações bioquímicas.

AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO

O método utilizado para a determinação dos níveis de ERO será baseado na fluorescência da oxidação da 2,7-dicloro-dihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA) em diclorofluoresceína (DCF), a concentração de nitrito através da reação de Griess (HUANG et al., 2009), o conteúdo tiólico total através do método descrito por AKSENOV e MARKESBERY (2001), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) pelo método de ESTERBAUER e CHEESEMAN (1990) a atividade da superóxido dismutase pelo método de MISRA e FRIDOVICH (1972), catalase (AEBI, 1984) e da glutationa S-transferase (Habig et al. 1974).



ATIVIDADE E EXPRESSÃO DE ENZIMAS COLINÉRGICAS

A determinação da atividade da AChE, é um método que baseia-se na formação do ânion amarelo 5-tio-2-nitrobenzoato, que pode ser determinado por espectrofotômetro em 412 nm, em cinética por 2 minutos a cada 30 segundos a 25°C. A atividade da enzima será expressa em μmol AcSCh/hora/mg de proteína (ELLMAN et al., 1961).
A expressão de RNAm dos genes das enzimas AChE e ChAT das amostras de hipocampo, córtex cerebral e cerebelo será realizada por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) conforme metodologia descrita previamente (TEIXEIRA et al., 2020).

ANÁLISES MOLECULARES

Determinação de citocinas
A quantificação das citocinas nas amostras dos homogeneizados cerebrais será avaliada por ensaio imunoenzimático (ELISA) através de kits comerciais para IL-6 e IL-10 (R&D Systems).

Expressão gênica de IR, IRS-1, PI3K, AKT e GSK-3β
A expressão gênica de receptor de insulina (IR), o substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1), PI3K, AKT, GSK-3β será realizada por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) conforme metodologia descrita previamente (AKHTAR et al., 2020).

Níveis de enzima que degrada a insulina (IDE)
A enzima de degradação da insulina (IDE) será detectada e quantificada pelo kit ELISA, de acordo com as instruções do fabricante. Os cálculos serão realizados com relação à curva padrão e os resultados expressos como enzima degradante da insulina (ng/ml) conforme descrito por AKHTAR et al. (2020).

Proteína Tau Fosforilada

A quantificação da fosforilação da proteína Tau nas amostras dos cerebrais será avaliada por ensaio imunoenzimático (ELISA) através kits comerciais, de acordo com as instruções do fabricante.

ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística será realizada por ANOVA de uma via seguido do teste post hoc de Tukey, utilizando o software GraphPad PRISM 5. Os resultados serão expressos como média ± erro médio padrão e serão considerados como diferença estatística, os dados que apresentarem P < 0,05.

Resultados prévios do nosso grupo de pesquisa têm demonstrado que antocianinas podem prevenir déficits comportamentais e bioquímicos em um modelo de demência tipo Alzheimer induzido por estreptozotocina em ratos. Esses resultados têm sido significantes uma vez que estes estudos sugerem o papel neuroprotetor das antocianinas associado a doenças neurodegenativas.
Dando continuidade a estes trabalhos acredita-se que os resultados deste projeto contribuirão para esclarecer mecanismos moleculares, bioquímicos e morfológicos associados a déficits cognitivos e a fisiopatologia da doença de Alzheimer. Espera-se também a partir desse trabalho caracterizar e entender os mecanismos para o uso de fitonutrientes no contexto da deteriorização cognitiva, principal característica da patogênese da doença de Alzheimer, avaliando os caminhos biológicos, fisiológicos e bioquímicos implicados no desenvolvimento inicial e progressivo dessa doença em modelos animais, bem como os efeitos da utilização de fitonutrientes como tratamento de curto ou em longo prazo.
Por outro lado, espera-se também que os artigos produzidos a partir dos resultados obtidos deste estudo sejam bem aceitos pelos revisores e corpos editorias das revistas para as quais serão submetidos, para que assim possa haver uma maior divulgação do assunto na comunidade científica. Além disso, o desenvolvimento deste projeto será importante para a formação de pessoal com qualificação, uma vez que o projeto será desenvolvido por alunos de mestrado, doutorado e de iniciação científica sob a supervisão do coordenador do projeto.