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O tratamento da obesidade deve ter como objetivo atingir o déficit calórico, tornando as intervenções dietéticas hipocalóricas um dos instrumentos mais utilizados na prática clínica. Todavia, a taxa de insucesso é alta, a perda de peso geralmente é menor do que o hipotetizado, e a aderência a longo prazo é rara (MONNIER et al., 2021). Inúmeras dietas com diferentes proporções de macronutrientes emergiram nos últimos tempos, e mesmo que resultados positivos sejam observados a curto prazo, a longo prazo observa-se que prevalência da obesidade ascende, demonstrando que um foco somente no aspecto calórico da dieta ignora o ambiente promotor de obesidade em que vivemos (ALVARENGA, 2015).
Os dados epidemiológicos que apontam o crescimento no número de obesos demonstram que a transição nutricional de um padrão alimentar tradicional, baseado em alimentos com menor nível de processamento para uma crescente presença de alimentos ultraprocessados teve papel importante neste desfecho (CANHADA et al., 2020; MONTEIRO et al., 2011). Desta forma, o incentivo a uma alimentação rica em alimentos in natura, em detrimento a alimentos ultraprocessados, aparece como uma alternativa dietética com potencial para a prevenção e tratamento da obesidade, devido a seu baixo conteúdo calórico, rico em fibras e antioxidantes (WHO AND FAO, 2003).
Para que a correlação entre consumo de alimentos com alto nível de processamento e o desenvolvimento da obesidade seja determinada, estudos pré-clínicos como o presente são necessários, acumulando assim evidências que incentivem a diminuição de sua participação nos hábitos alimentares da população e incitem a recuperação de hábitos alimentares típicos brasileiros, os quais são ricos tanto nutricionalmente quanto culturalmente, como reforça a regra de ouro do Guia Alimentar para a população Brasileira (BRASIL, 2014).

Animais
Os cuidados com os animais seguirão a Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou Pesquisa Científica – CONCEA e este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal – CEEA sob o número de cadastro 030956/2021-27. Serão utilizados 80 ratos machos com 90 dias, da linhagem Wistar (Rattus norvegicus) advindos do Biotério Central da Universidade Federal de pelotas - UFPEL. Os animais deverão passar por fase de aclimatação recebendo ração comercial, e água em regime ad libitum por uma semana, antes de serem separados aleatoriamente entre os grupos de intervenção ou controle. Os animais serão mantidos em caixas de polipropileno em temperatura controlada (24±28°C) e com ciclo claro-escuro de 12-12h. Ao final do protocolo experimental os animais deverão ser anestesiados e eutanasiados.

Protocolo experimental
Após o período de adaptação de uma semana os animais (n = 80) serão aleatoriamente divididos em quatro grupos com diferentes dietas (n = 16 por grupo), sendo três grupos de intervenção e dois grupos controle. A intervenção dietética terá duração de 6 semanas e o acesso às dietas e água será ad libitum. Os ratos serão divididos em:
• Dieta in natura (DIN)
• Dieta Brasileira Contemporânea (DBC)
• Dieta Ultraprocessada (DUP)
• Controle Hipercalórico (CH) e Controle Normocalórico (CN)
Para que possa ser avaliado o impacto do grau de processamento dos alimentos da dieta na etiologia da obesidade as dietas deverão ser hipercalóricas, e com conteúdo similar de calorias entre os grupos (isocalóricas), no entanto, os macronutrientes de cada direta serão diferentes conforme o grupo. Os animais deverão ter o peso corporal determinado semanalmente por balança analítica. O cálculo amostral foi realizado utilizando o programa GPower.

Dietas Experimentais: As dietas controle serão adquiridas comercialmente e serão confeccionadas outras 3 intervenções dietéticas a partir de alimentos em sua forma integral.

Dieta Brasileira Contemporânea (DBC): A DBC terá 25% de participação de ultraprocessados em seu conteúdo calórico total e o restante das calorias será advindo de alimentos minimamente processados e ingredientes culinários (ex: óleo de soja, açúcar e sal).

Dieta Ultraprocessada: A (DUP) terá o dobro do conteúdo de ultraprocessados em relação a DCB, representando uma projeção futura de consumo, visto que a participação destes alimentos na dieta brasileira cresce gradativamente, podendo chegar aos altos padrões de consumo de países desenvolvidos. Assim, a DUP terá 50% de seu conteúdo composto por alimentos ultraprocessados e o restante das calorias será advindo de alimentos processados e minimamente processados.

Dieta in natura (DIN): A dieta in natura será composta por 100% de alimentos com o mínimo processamento industrial, rica em alimentos de origem vegetal e com alto conteúdo de fibras dietéticas. A DIN será uma representação do padrão dietético brasileiro tradicional, contendo, além de alimentos in natura e minimamente processados, somente ingredientes culinários como açúcar, sal e gorduras como o óleo de soja. Serão utilizados os alimentos com maior participação na dieta brasileira.

Características gerais da dieta:
A apresentação das dietas será peletizada, formato mais utilizado experimentalmente que permite incrementação e melhor eficiência na utilização das dietas, o processo envolve temperatura, umidade e pressão (MARTINS et al., 2013). O conteúdo nutricional quanto a dosagem de macronutrientes de ambas as dietas deverá ser avaliado através da avaliação da composição centesimal. Para avaliação do consumo alimentar a oferta de alimentos do dia deverá ser pesada, assim como as sobras no dia posterior, considerando um valor de perda.

Parâmetros Bioquímicos
Amostras sanguíneas deverão ser coletadas pós intervenção e eutanásia dos animais, centrifugadas e armazenadas em freezer para posterior análise. A análise das amostras para dosagem dos níveis séricos de Insulina, Leptina e Grelina será feita através de ensaio de ELISA. Os procedimentos de coleta, preparação e análise da amostra seguirão procedimentos anteriormente documentados (TOLAZZI, 2015).

Análise da adiposidade corporal
Após a eutanásia dos animais os principais depósitos de tecido adiposo deverão ser retirados, tais como o tecido adiposo intraperitoneal, epididimal, omental, mesentérico e retroperitoneal. Os tecidos serão então dissecados e pesados. Para definição de adiposidade corporal deverá ser utilizada fórmula previamente descrita do Índice de Adiposidade (IA%), que leva em conta o peso corporal final (PCF) do animal medido por balança analítica e o peso do tecido adiposo (GC): ([GC]/PCF) × 100 (TAYLOR; PHILLIPS, 1996).

Análise da Microbiota Intestinal
A análise da microbiota se dará por extração de DNA bacteriano fecal e análise através de Real Time Polymerase Chain reaction - RT-PCR. As amostras fecais deverão ser colhidas individualmente, diariamente em horário determinado durante todo o período experimental e mantidas a -80 °C até análise.

Análise de Ácidos Graxos de Cadeia Curta
Para identificação e quantificação de AGCC’S amostras de fezes previamente congeladas (20mg) serão preparadas por liofilização, acidificação (ácido fosfórico ou fórmico) e centrifugação. Também serão analisados os ACGCC’s do ceco. A extração do conteúdo de AGCC’s do ceco acontecerá por meio da suspensão e homogeneização da amostra em água, seguido de ajuste do pH; esta suspensão deverá ser centrifugada para obtenção de um sobrenadante limpo o qual será injetado em cromatógrafo para quantificação dos AGCC’s (ZHAO et.al, 2005).

Análise do Perfil Oxidativo
A avaliação do perfil oxidativo será avaliada em amostras de soro ou plasma dos animais conforme segue:

Determinação de espécies reativas (ER)
A formação de espécies reativas será estimada de acordo com Ali et al. (1992). Uma alíquota de soro será incubada com 2', 7'-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA, 7 µM). A oxidação de DCFH-DA para diclorofluoresceína (DCF) será medida para a detecção de ER intracelulares. A intensidade de emissão de fluorescência de DCF será registrada a 525 e 488 nm de excitação 60 min após a adição de DCFH-DA no meio. A DCF oxidada será determinada utilizando uma curva padrão e os resultados serão expressos em nM DCF/mL soro.

Determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
A peroxidação lipídica em soro será estimada pela medição de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), como malondialdeído (MDA, a 532 nm) através do método de Jentzch et al. (1996) com modificações. Os resultados serão expressos como nmol de MDA/mL de soro.

Determinação dos níveis de tióis totais (TSH) e tióis não proteicos (NPSH)
Os resultados serão expressos como mmol de TSH/mL de plasma. Para a determinação de NPSH, 200 µL da amostra será precipitada com 200µL de ácido tricloroacético 10% seguido por centrifugação (1050 g, 10 min), o sobrenadante desta centrifugação será utilizado para análise. O ensaio colorimétrico será realizado em tampão de fosfato 1 M, pH 7,4. Os resultados serão expressos como mmol de NPSH/mL de plasma (ELLMAN, et al., 1961).

Determinação dos níveis de ácido ascórbico
A determinação do conteúdo de ácido ascórbico (Vitamina C) em soro será realizada como descrito por Jacques-Silva et al, (2001). O conteúdo de ácido ascórbico será determinado a 520 nm e expresso como g de ácido ascórbico/mL de soro.

Ensaio da enzima Catalase (CAT)
A atividade da enzima catalase será determinada em sangue total segundo o método espectrofotométrico de Nelson e Kiesow, (1972), pelo monitoramento do consumo de H2O2 através da medida da diminuição da absorbância a 240 ɳm, em uma mistura de reação contendo H2O2 15 mM em tampão KPO4 50 mM (pH 7.0) e 30 µl de material enzimático. A atividade da catalase será expressa em ΔE/min/mg de proteína.

Ensaio da enzima Superóxido dismutase (SOD)
A atividade da SOD será analisada pelo sistema de detecção Adrenalina – Adenocromo de acordo com Mc. Cord e Fridovich, (1969). A reação de cor será medida a 480 nm. A atividade enzimática será expressa em unidades de SOD/mg de proteína.

Determinação de proteínas
O conteúdo proteico das amostras para ensaio de atividade enzimática, será determinado de acordo com Bradford (1976), utilizando albumina de soro como padrão.

Análise Estatística
Após a coleta de dados os resultados deverão ser analisados em software estatístico utilizando análise de variância (ANOVA), seguido de teste Tukey para médias de diferença entre os grupos.

O presente estudo pretende contribuir para preencher a lacuna de evidências experimentais acerca do impacto do processamento industrial de alimentos em parâmetros importantes para o desenvolvimento da obesidade; tema já bastante explorado por estudos epidemiológicos (LANE et al., 2021), e que requer mais dados obtidos com rigor metodológico para que uma correlação seja definida entre o consumo destes alimentos e desfechos na saúde. Entretanto, para que resultados de estudos pré-clínicos na temática da etiologia da obesidade possam determinar causa e efeito e ter reprodutibilidade para estudos clínicos é necessário que a metodologia utilizada, sobretudo quanto as intervenções dietéticas, simulem satisfatoriamente o ambiente alimentar de uma população.
Além disso, espera-se ser um dos primeiros estudos experimentais que utilizem a classificação NOVA em sua metodologia, assim como enaltecer a produção científica brasileira, contribuindo para o acúmulo de evidências experimentais sobre o tema, e visando propor padronização metodológica para maior comparação entre estudos de intervenções dietéticas. A hipótese do estudo é que quanto maior a participação de alimentos ultraprocessados na dieta, maior será o impacto em parâmetros reguladores da fome e saciedade, ingestão calórica, marcadores bioquímicos, modulação da microbiota intestinal, e adiposidade devido ao conteúdo insuficiente de fibras e presença de aditivos tais como adoçantes artificiais, corantes, emulsificantes, entre outros os quais são adicionados industrialmente; e em contraste, a dieta baseada em alimentos minimamente processados possivelmente seja correlacionada com desfechos favoráveis a uma melhor saúde e menor adiposidade.