Nome do Projeto
Neorickettsia risticii: distribuição geográfica e expressão da proteína 51kDa (P51) em Pichia pastoris e Escherichia coli
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/01/2022 - 01/07/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
A Neorickettsiose equina (EN), severa doença diarreica febril, é uma enfermidade sistêmica aguda, potencialmente fatal, cujos índices de mortalidade podem alcançar 20 a 25%. Seu agente etiológico é a Neorickettsia (Ehrlichia) risticii bactéria endossimbionte de trematódeos digenéticos , cujas proteínas de superfície, críticas para o reconhecimento imunológico, não foram completamente caracterizadas, sendo o antígeno de 51 kDa (P51) identificado como a principal proteína da membrana externa exposta à superfície de cepas de N. risticii, contra as quais os cavalos infectados desenvolvem anticorpos no início da infecção. Visando a minimização dos impactos à criação de equinos no Estado do Rio Grande do Sul, este projeto consiste em mapear e atualizar a distribuição geográfica da Neorickettsia risticii a partir de questionário, aliado à pesquisa de campo, bem como a confirmação de locais suspeitos através de coletas ambientais e posterior processamento de amostras, objetivando a extração do DNA e Reação em Cadeia de Polimerase – PCR, a fim de expressar e caracterizar a proteína 51 kDa (P51) em Pichia pastoris e Escherichia coli, vislumbrando o início do trajeto para a primeira vacina brasileira contra a Neorickettsiose equina. Acrescenta-se a importância de atualizar o conhecimento disponível sore a enfermidade através de uma revisão sistemática.

Objetivo Geral

A presente proposta tem como objetivos delimitar a distribuição geográfica da Neorickettsia risticii, encontrando possíveis focos de sua ocorrência a partir de informações oriundas de veterinários e criadores de cavalos crioulos, avançando a partir desse ponto para a expressão e caracterização da proteína 51 kDa (P51) em Pichia pastoris e Escherichia coli, uma vez que as proteínas estão associadas à variação antigênica das cepas, e são reconhecidas como potenciais candidatas a contribuir no avanço dos métodos de diagnósticos e desenvolvimento da vacina contra a Neorickettsiose Equina no Brasil.

Justificativa

Segundo dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) a equinocultura brasileira movimenta anualmente cerca de R$ 16,15 bilhões e impulsiona o setor econômico primário do país. De acordo com Said et al. (2016), a expansão da exportação de cavalos vivos cresceu significativamente entre 1997 e 2009, alcançando 524%. O alto potencial zootécnico da raça Crioula vem expandindo o mercado destes animais, uma vez que a raça totaliza um número superior a 439,43 mil exemplares registrados no país. A realização de eventos nas chamadas regiões de fomento também foram determinantes para a expansão da raça no país. Em 2019 foram promovidos 1019 eventos, entre provas e exposições, com a participação de 21,3 mil exemplares (ABCCC). No Rio Grande do Sul, além do aspecto econômico, a atividade está diretamente ligada ao lazer, cultura, esporte e trabalho. Os costumes vinculados às tradições gaúchas trazem a tona, uma maior importância a criação de cavalos no Estado gaúcho (COSTA et al., 2013).
A Neorickettsiose equina (EN) é considerada uma das mais frequentes causas de colites nas manadas, com sinais clínicos que incluem diarreia aquosa, febre, depressão, letargia, diminuição do apetite evoluindo à anorexia, cólica e desidratação (RIKIHISA; PERRY, 1985). Responsável por grandes perdas econômicas e emocionais, a diarreia ocorre de forma leve, transitória ou mesmo persistente em 30% dos casos, enquanto a laminite se desenvolve em cerca de 25%, além de, segundo PUSTERLA (2013) ser considerada abortiva.
Devido a dificuldade relacionada ao isolamento da N. risticii, até o momento poucas regiões acometidas já tiveram suas cepas isoladas e por esta razão, sua diversidade, disseminação e distribuição ambiental permanecem mal compreendidas (RIKIHISA et al., 2016). Embora a doença seja cada vez mais reconhecida nas Américas do Norte e do Sul, a N. risticii não havia sido cultivada fora dos Estados Unidos, até que, pela primeira vez foi cultivada uma cepa canadense (XIONG et al., 2016).
A imunidade humoral é considerada importante na defesa do hospedeiro contra a Neorickettsiose equina (RIKIHISA et. al. 1993 e VEMULAPALLI et al. 1995). Estudos apontam que a transferência passiva de antissoros de cavalo para N. risticii ou anticorpos de camundongo para N. risticii (antisoro ou imunoglobulina G purificada) confere proteção a camundongos contra infecção por desafio de N. risticii, indicando a mediação da imunidade pelo anticorpo (RIKIHISA et al. 1993; Kaylor et al. 1991).
Em seu estudo, DUTTA et al. (1989) afirmou que, apesar do pouco conhecimento sobre as proteínas expostas à superfície de N. risticii, sabia-se que esta informação seria crucial para a compreensão das interações bactéria-célula hospedeira.
De acordo com GIBSON et al. (2011), os resultados da proteômica realizados em duas cepas de N. risticii estabeleceram que a P51 trata-se de uma proteína dominante expressa na superfície, corroborando com VEMULAPALLI et al. (1998), que afirmava que uma proteína de 51 kDa (p51) seria o principal antígeno reconhecido em cavalos com Neorickettsiose equina, encontrada consistentemente em todas as cepas de N. risticii identificadas até o momento do estudo e que, de acordo com o banco de dados GenBank, não é observada em nenhuma outra bactéria conhecida (DUTTA et al., 1998; KANTER et al., 2000), tornando-a segundo PARK et al., (2005) por estes motivos um alvo potencial para o desenvolvimento de método de diagnóstico eficaz ou imunoprofilático do agente, como possivelmente uma vacina de DNA recombinante contra a Neorickettsiose equina.
Apesar da variação da sequência de aminoácidos P51 entre as cepas de N. risticii , este forte reconhecimento sugere que rP51 pode servir como um antígeno sorodiagnóstico definido. Além disso, o estudo aponta que existem sequências de peptídeos conservados imunodominantes dentro de P51 que podem servir como antígenos de diagnóstico de PHF ainda mais específicos (GIBSON et al., 2011).
A levedura metilotrófica P. pastoris é amplamente utilizada para expressão de proteínas heterólogas, em detrimento de outros sistemas de expressão, por ser de fácil manipulação genética, expressar proteínas heterólogas em níveis elevados, promover O- e N-glicosilação e processar sequências sinais com rapidez, facilidade e economia (CREGG et al., 2000; AHMAD et al., 2014).
Sabe-se que atualmente a taxa de mortalidade dos casos clínicos da Neorickettsiose Equina varia de 17 a 36%. Considerando-se que o curso da doença sem intervenção terapêutica ocorre geralmente de 5 a 10 dias, espaço de tempo relativamente curto para o diagnóstico de enfermidades em geral, fator este que gera grande impacto a indústria de cavalos, o que demonstra urgência no desenvolvimento de vacina eficaz com cepas locais, próprias de cada região acometida (XIONG et al., 2016).

Metodologia

Será desenvolvido um questionário a fim de mapear a ocorrência de casos compatíveis com a sintomatologia clínica da Neorickettsiose equina, para que sejam realizadas coletas ambientais nas propriedades, com o objetivo de identificar a presença da bactéria na região através da extração de DNA das amostras, e posterior Reação em cadeia de Polimerase (PCR). A partir deste ponto, a pesquisa avançará para a expressão da proteína P-51 em P. pastoris e E. coli.

Questionário
Uma vez que a pandemia da covid-19 e o consequente isolamento social impedem a realização do questionário de forma presencial, optou-se pela coleta de dados utilizando a Plataforma Google Forms como ferramenta remota para alcançar pessoas diretamente envolvidas na criação de cavalos da raça crioula. Ao iniciar a coleta de dados, um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) virtual será inserido, composto por uma página de esclarecimento sobre a pesquisa, além da solicitação de autorização para o uso dos dados.
Perguntas serão elaboradas de forma minuciosa e posteriormente revisadas por veterinários, leigos e criadores de cavalos crioulos, objetivando captar informações essenciais para a determinação de possíveis focos da doença, como por exemplo investigar a presença de diarreia com ou sem morte de equinos nas propriedades, bem como os meses de maior incidência dos casos, fontes de irrigação, entre outras.
Será realizada ampla divulgação da pesquisa, com o apoio da Associação Brasileira de Criadores de Cavalos Crioulos (ABCCC) nos meios virtuais mais utilizados pela população do estudo, contando com a postagem do link do questionário em diversos ambientes virtuais como: grupos de whatsapp, site da ABCCC, entrevista a emissora “Rádiosul.net” além do uso de mala direta de e-mails e redes sociais (Instagram e Facebook).

Coletas ambientais
Coletas ambientais de caramujos, aguapés e suas raízes, bem como a água do ambiente ocorrerão em alguns dos locais já descritos em literatura e anteriormente classificados como endêmicos a Neorickettsiose equina. Serão incluídas à rota de coletas, aqueles locais onde já foram registrados casos com sintomatologia compatível a da enfermidade, baseado nos resultados obtidos nos questionários.

Extração de DNA, Reação em cadeia de Polimerase (PCR) e Expressão das proteínas em P. pastoris e E. coli
As etapas laboratoriais serão realizadas no Laboratório de Saúde Coletiva – LASC, do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, em parceria com o Laboratório de Micologia Veterinária e também com o Laboratório de Biologia Molecular Veterinária – LaBMol-Vet, todos situados na Universidade Federal de Pelotas (UFPEL) no Rio Grande do Sul.
Após o processamento das amostras coletadas, será realizada a extração de DNA das mesmas e posterior Reação em cadeia de Polimerase (PCR), cujas técnicas utilizadas serão as descritas por BARLOUGH et al. (1998): Fenol-clorofórmio e Nested PCR, respectivamente.
A fim de caracterizar as propriedades de 51 kDa de N. risticii realizaremos estudos da expressão in vitro da proteína de 51 kDa na linha de células de P. pastoris e posteriormente em E. coli.

Indicadores, Metas e Resultados

Considerando que a pesquisa virtual seja um meio rápido, econômico e com bom aproveitamento de respostas, pressupõe-se que o estudo acarretará no aumento do conhecimento sobre possíveis casos clínicos da doença em diversas localizações do Rio Grande do Sul, possivelmente acometidas e todavia não diagnosticadas, delimitando a distribuição geográfica da Neorickettsia risticii, visando um melhor direcionamento para as coletas ambientais, para que estas venham a gerar subprodutos para a caracterização da proteína 51 kDa (P51) e posterior expressão em Pichia pastoris e Escherichia coli, presente nas amostras locais, previamente detectadas através de Nested PCR.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
DANIELA APARECIDA MOREIRA
JULIANA GARCIA DA SILVA TEIXEIRA
LUIZ FILIPE DAME SCHUCH2
MARCIELE COSTA COLVAR
MARIO CARLOS ARAUJO MEIRELES2
RODRIGO CASQUERO CUNHA2
SARA DA SILVA SANTIAGO

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