Nome do Projeto
Envolvimento de genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico na tolerância à estresses abióticos e menor acúmulo de arsênio em arroz
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/03/2022 - 28/02/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
O arroz é um dos principais alimentos para grande parte da população mundial, inclusive no Brasil. Diferentes estresses abióticos impactam negativamente a produtividade e a qualidade do arroz no Rio Grande do Sul, principal produtor do País. No Estado, em determinadas regiões, pela proximidade com o oceano, ocorre a salinização da água de irrigação, o que causa danos na cultura, além de elevar o nível de sais no solo. A ocorrência de baixas temperaturas é outro entrave para o cultivo do arroz no Sul do Brasil, causando atraso na germinação e esterilidade das espiguetas. Além disso, em solos alagados do Rio Grande do Sul há maior disponibilidade de ferro (Fe) na forma FeII e arsênio (As) na forma AsIII, que são absorvidos pela planta. O Fe quando absorvido em excesso causa toxidez, levando a redução da produtividade, e o As, agente cancerígeno, é acumulado no grão em quantidade acima do permitido no País. Algumas pesquisas têm demonstrado o envolvimento do óxido nítrico na tolerância a diferentes estresses abióticos e na redução do acúmulo de As em certas espécies. No entanto, a dinâmica do óxido nítrico em arroz sob condição de estresse e no acúmulo de As não está clara. Dessa forma, a hipótese desse estudo é que a tolerância a estresses abióticos de algumas cultivares de arroz, assim como, o menor acúmulo de As no grão, são decorrentes da maior síntese de óxido nítrico nessas cultivares quando submetidas a essas condições. Devido às características da molécula, a quantificação de óxido nítrico é muito difícil, por isso, sugere-se inferir sobre a sua presença de forma indireta, ou seja, através da análise de expressão dos genes envolvidos na sua síntese. Nesse sentido, a caracterização de genes envolvidos na síntese de óxido nítrico pode ser uma alternativa útil para elucidar, de forma indireta, a participação dessa molécula na tolerância a estresses e no acúmulo de As em arroz. Além disso, a caracterização desses genes pode ser favorável para o desenvolvimento de novos genótipos de arroz com maior capacidade de lidar com estresses abióticos e As. Diante do exposto, essa proposta visa elucidar o envolvimento dos genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico na tolerância à estresses abióticos e menor acúmulo de As em arroz.
Objetivo Geral
Verificar o envolvimento dos genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico na tolerância à salinidade, baixas temperaturas, toxidez por Fe e no acúmulo de As em arroz.
Justificativa
O arroz (Oryza sativa L.) é segundo cereal mais consumido do mundo, sendo uma das principais culturas alimentares para mais da metade da população mundial, por isso está diretamente associado com a segurança alimentar (Li et al. 2018; Jeyasri et al. 2021). No Brasil a situação não é diferente, onde quase 95% dos brasileiros consomem arroz, dos quais mais da metade ingerem esse alimento no mínimo uma vez ao dia (Oliveira Neto 2015). A produtividade do arroz pode ser afetada pela ocorrência de estresses abióticos (Dar et al. 2021) e a qualidade pode ser comprometida devido ao acúmulo de arsênio (As) no grão (Yuan et al. 2021).
No Brasil, diferentes estresses abióticos impactam negativamente a produtividade do arroz. O sistema de cultivo de arroz utilizado no RS, principal produtor do País, é o irrigado por inundação, com manutenção de lâmina d’água, proveniente de rios, córregos, lagos, lagoas e reservatórios de águas subterrâneas. A Lagoa do Patos é fonte de água de irrigação para as lavouras de arroz da região Sul e da Planície Costeira. Em determinadas épocas do ano, ocorre entrada da água do Oceano na Lagoa (Fraga et al. 2010), o que pode causar danos à cultura.
A salinidade ocorre quando há uma alta concentração de sais solúveis, e um solo salino é aquele que apresenta condutividade elétrica de 4dS m-1. O limiar do arroz para o estresse salino é de 3dS m-1, com uma redução de 12% no rendimento, por dS m-1 além deste valor. A sensibilidade do arroz ao sal varia de acordo com o estádio de desenvolvimento, sendo a germinação o estádio em que a planta apresenta maior tolerância. No estádio de plântula se torna sensível à salinidade, e no estádio vegetativo recupera a tolerância. O estádio reprodutivo se caracteriza pela maior sensibilidade da planta ao estresse ocasionado por salinidade (Negrão et al. 2011; Chen et al. 2021).
Devido à localização geográfica, a ocorrência de baixas temperaturas é outro entrave para o cultivo do arroz no Sul do Brasil, assim como em outros locais do mundo (Cruz et al. 2013). O grau de injuria que as baixas temperaturas causam no arroz depende do estádio de desenvolvimento, severidade do frio e duração do estresse. No RS o arroz é semeado de setembro a dezembro, com predominância nos meses de outubro e novembro, período em que a temperatura média é de 15ºC (Cruz et al. 2004). Embora essa temperatura não impeça a germinação, atrasa a emergência das plântulas, já que a faixa ótima de temperatura para germinação se situa entre 20ºC e 35ºC, sendo que abaixo de 10ºC o arroz não germina. No estádio vegetativo, baixas temperaturas ocasionam o amarelecimento das folhas, baixa estatura de plantas e menor perfilhamento (Cruz et al. 2013; Yadav 2010).
No estádio reprodutivo, ocorre maior sensibilidade a baixas temperaturas, sendo a temperatura de 18-20ºC limite para ocorrência de danos. Nessa fase, baixas temperaturas ocasionam esterilidade das espiguetas devido ao aborto do grão de pólen e anormalidade na antese, impactando o rendimento de grãos. No enchimento de grãos baixas temperaturas causam atraso e maturação incompleta de grãos (Cruz et al. 2013; Yadav 2010). No RS é comum a ocorrência de baixas temperaturas noturnas no mês de fevereiro, coincidindo com o estádio reprodutivo de algumas cultivares, o que pode resultar na esterilidade das espiguetas e redução da produtividade.
A toxidez por excesso de ferro (Fe) é uma condição adversa que pode ocorrer em áreas de cultivo de arroz irrigado no Sul do Brasil, Oeste da África, Sudeste da Ásia e Madagascar (Becker et al. 2005; Liu et al. 2016). O Fe no solo é encontrado principalmente nas formas de íon férrico [Fe(III)] e o íon ferroso [Fe(II)] (Hori et al. 2015). Enquanto que a forma Fe(III) é insolúvel e de difícil absorção pelas raízes, a forma Fe(II), é solúvel e prontamente disponível para as plantas. O pH baixo e a ausência de oxigênio em solos submersos de cultivo de arroz favorecem a redução de Fe(III) para forma mais solúvel Fe(II).O alto nível de Fe(II) encontrado em solos alagados pode causar toxidez nas plantas de arroz (Mongon et al. 2014).
A toxidez por Fe pode ocorrer devido à absorção demasiada e acúmulo deste elemento nos tecidos, seguido de aparecimento de bronzeamento das folhas (Becker e Asch 2005; Morrissey e Guerinot 2009). O bronzeamento é causado pelo acúmulo de polifenóis oxidados na presença de altos níveis de Fe (revisado em Müller et al. 2015). Além disso, o Fe participa da Reação de Fenton catalisando a geração de radicais hidroxila (OH) e EROs, que causam danos irreversíveis na célula (Wu et al. 2014). Ainda, a toxidez por Fe impede a captação, transporte e utilização de nutrientes em função do acúmulo de Fe sobre as raízes (Sahrawat 2004). Ambas as formas de toxidez afetam a produtividade.
Tem sido verificado que em alguns países, incluindo o Brasil, o arroz acumula arsênio (As) no grão em quantidade superior ao permitido (Kato et al. 2019; Fão et al. 2019; Monteiro et al. 2020; Oliveira et al. 2021; Harine et al. 2021). O As pode ser encontrado nas formas orgânica e inorgânica (iAs) (ATSDR 2007), sendo o As orgânico menos tóxico que o As inorgânico (Medda et al. 2020). No solo, as formas inorgânicas são mais prevalentes que as formas orgânicas, e dentre as formas inorgânicas, o As(V) (arsenato) é menos tóxica e está presente na forma de minerais imóveis, enquanto que o As(III) (arsenito) é mais tóxica e mobilizado na água (Shrivastava et al. 2015).
Em solos anaeróbicos, como os submersos utilizados no cultivo de arroz, a forma predominante é o As(III), pois nessas condições o As(V), forma oxidada de iAs, é reduzido a As(III) (Beans 2021). A captação de As(III) pelas plantas ocorre por membros da família de aquaporinas (nodulin 26-like intrinsic protein – NIP), que também captam silício (Ma et al. 2008). Como o arroz é uma das espécies que mais acumula silício e é cultivado em solo anaeróbico, acumula altos teores de As(III) (Awasthi et al. 2017).
Diferentes estudos têm sido conduzidos para elucidar os mecanismos de resposta a estresses abióticos em plantas, assim como os mecanismos envolvidos na captação, transporte e acúmulo de As. Dentre os avanços obtidos, pode-se destacar o envolvimento do óxido nítrico (NO) na tolerância a diferentes estresses abióticos (Fancy et al. 2017; Cao et al. 2019; Li et al. 2019; Sánchez-Vicente e Lorenzo 2021; Tewari et al. 2021) e na redução do acúmulo de As (Singh et al. 2016).
A síntese de NO em plantas não está completamente elucidada, mas sabe-se que ocorre a partir de duas rotas principais, uma de redução (redução de nitrito a NO) e uma de oxidação (oxidação de moléculas aminadas). Na planta, a redução do nitrito a NO pode ocorrer pelas vias não enzimática e enzimática (Astier et al. 2018). A redução do nitrito a NO pela via não enzimática é rara e ocorre em situações muito particulares, de baixo pH, ambiente com alto poder redutor e quantidades elevadas de nitrato (Bethke et al. 2004). A redução do nitrito a NO pela via enzimática envolve as enzimas nitrato redutase (NR), nitrito:NO redutase (Ni-NOR) (NR específicas de membrana das raízes) e xantina oxidase (XOR-like) (Tewari et al. 2021). A enzima NR reduz nitrato a nitrito e também catalisa a transferência de elétrons de NAD(P)H para nitrito, formando NO. As enzimas Ni-NOR convertem nitrito a NO usando como doador de elétrons NAD(P)H. A enzima XOR também é capaz de reduzir nitrato orgânico, nitrato inorgânico e nitrito, liberando NO (Procházková e Pavlíková 2014; Astier et al. 2018).
Há muitas evidências que produção de NO a partir da oxidação em plantas é similar ao descrito para animais. Em animais, enzima oxido nítrico sintase (NOS) catalisa a formação de NO e L-citrolina a partir de L-arginina por meio de mono-oxigenação dupla (Astier et al. 2018). No entanto, ainda não foram identificados homólogos dos genes NOS em plantas superiores, apenas em algas verdes. Como um grande número de estudos foi desenvolvido em plantas superiores, e homólogos de NOS nunca foram detectados, existe a hipótese de ausência de NOS nessas espécies. Outros estudos sugerem a existência de uma rota alternativa de síntese de NO via oxidação, com atividade semelhante à NOS, denominada NOS-like (atuação de outros genes, diferentes de NOS) (Astier et al. 2018).
Como mencionado, o NO parece estar envolvido com a tolerância a estresses abióticos e no metabolismo do As em plantas. No entanto, a dinâmica do NO em arroz sob condição de estresse e no acúmulo de As não está clara. Nesse sentido, a hipótese desse estudo é que a tolerância a estresses abióticos de algumas cultivares de arroz, assim como o menor acúmulo de As, são decorrentes da maior síntese de NO nessas cultivares sob essas condições.
A quantificação de NO é muito difícil pois é uma molécula gasosa, de meia vida curta, e com interferência de vários metabólitos (Vishwakarma et al. 2019). Mas mesmo assim, alguns métodos de detecção têm sido utilizados, como o descrito por Zhou et al. (2005). Quando uma molécula é de difícil mensuração, pode-se fazer a sua análise de forma indireta, ou seja, analisando a expressão dos genes (ou atividade das enzimas) envolvidos na sua síntese. Um exemplo é o etileno (fitohormônio gasoso), no qual a análise de expressão dos genes ACC oxidase e ACC sintase é um indicativo da quantidade desse fitohormônio nos tecidos (Vong et al. 2019; Soares et al. 2021). Nesse sentido, a caracterização de genes envolvidos na síntese de NO pode ser uma alternativa útil para elucidar de forma indireta a participação do NO na tolerância a estresses. Além disso, a caracterização desses genes pode ser favorável para o desenvolvimento de novos genótipos de arroz com maior capacidade de lidar com estresses abióticos e As.
No Brasil, diferentes estresses abióticos impactam negativamente a produtividade do arroz. O sistema de cultivo de arroz utilizado no RS, principal produtor do País, é o irrigado por inundação, com manutenção de lâmina d’água, proveniente de rios, córregos, lagos, lagoas e reservatórios de águas subterrâneas. A Lagoa do Patos é fonte de água de irrigação para as lavouras de arroz da região Sul e da Planície Costeira. Em determinadas épocas do ano, ocorre entrada da água do Oceano na Lagoa (Fraga et al. 2010), o que pode causar danos à cultura.
A salinidade ocorre quando há uma alta concentração de sais solúveis, e um solo salino é aquele que apresenta condutividade elétrica de 4dS m-1. O limiar do arroz para o estresse salino é de 3dS m-1, com uma redução de 12% no rendimento, por dS m-1 além deste valor. A sensibilidade do arroz ao sal varia de acordo com o estádio de desenvolvimento, sendo a germinação o estádio em que a planta apresenta maior tolerância. No estádio de plântula se torna sensível à salinidade, e no estádio vegetativo recupera a tolerância. O estádio reprodutivo se caracteriza pela maior sensibilidade da planta ao estresse ocasionado por salinidade (Negrão et al. 2011; Chen et al. 2021).
Devido à localização geográfica, a ocorrência de baixas temperaturas é outro entrave para o cultivo do arroz no Sul do Brasil, assim como em outros locais do mundo (Cruz et al. 2013). O grau de injuria que as baixas temperaturas causam no arroz depende do estádio de desenvolvimento, severidade do frio e duração do estresse. No RS o arroz é semeado de setembro a dezembro, com predominância nos meses de outubro e novembro, período em que a temperatura média é de 15ºC (Cruz et al. 2004). Embora essa temperatura não impeça a germinação, atrasa a emergência das plântulas, já que a faixa ótima de temperatura para germinação se situa entre 20ºC e 35ºC, sendo que abaixo de 10ºC o arroz não germina. No estádio vegetativo, baixas temperaturas ocasionam o amarelecimento das folhas, baixa estatura de plantas e menor perfilhamento (Cruz et al. 2013; Yadav 2010).
No estádio reprodutivo, ocorre maior sensibilidade a baixas temperaturas, sendo a temperatura de 18-20ºC limite para ocorrência de danos. Nessa fase, baixas temperaturas ocasionam esterilidade das espiguetas devido ao aborto do grão de pólen e anormalidade na antese, impactando o rendimento de grãos. No enchimento de grãos baixas temperaturas causam atraso e maturação incompleta de grãos (Cruz et al. 2013; Yadav 2010). No RS é comum a ocorrência de baixas temperaturas noturnas no mês de fevereiro, coincidindo com o estádio reprodutivo de algumas cultivares, o que pode resultar na esterilidade das espiguetas e redução da produtividade.
A toxidez por excesso de ferro (Fe) é uma condição adversa que pode ocorrer em áreas de cultivo de arroz irrigado no Sul do Brasil, Oeste da África, Sudeste da Ásia e Madagascar (Becker et al. 2005; Liu et al. 2016). O Fe no solo é encontrado principalmente nas formas de íon férrico [Fe(III)] e o íon ferroso [Fe(II)] (Hori et al. 2015). Enquanto que a forma Fe(III) é insolúvel e de difícil absorção pelas raízes, a forma Fe(II), é solúvel e prontamente disponível para as plantas. O pH baixo e a ausência de oxigênio em solos submersos de cultivo de arroz favorecem a redução de Fe(III) para forma mais solúvel Fe(II).O alto nível de Fe(II) encontrado em solos alagados pode causar toxidez nas plantas de arroz (Mongon et al. 2014).
A toxidez por Fe pode ocorrer devido à absorção demasiada e acúmulo deste elemento nos tecidos, seguido de aparecimento de bronzeamento das folhas (Becker e Asch 2005; Morrissey e Guerinot 2009). O bronzeamento é causado pelo acúmulo de polifenóis oxidados na presença de altos níveis de Fe (revisado em Müller et al. 2015). Além disso, o Fe participa da Reação de Fenton catalisando a geração de radicais hidroxila (OH) e EROs, que causam danos irreversíveis na célula (Wu et al. 2014). Ainda, a toxidez por Fe impede a captação, transporte e utilização de nutrientes em função do acúmulo de Fe sobre as raízes (Sahrawat 2004). Ambas as formas de toxidez afetam a produtividade.
Tem sido verificado que em alguns países, incluindo o Brasil, o arroz acumula arsênio (As) no grão em quantidade superior ao permitido (Kato et al. 2019; Fão et al. 2019; Monteiro et al. 2020; Oliveira et al. 2021; Harine et al. 2021). O As pode ser encontrado nas formas orgânica e inorgânica (iAs) (ATSDR 2007), sendo o As orgânico menos tóxico que o As inorgânico (Medda et al. 2020). No solo, as formas inorgânicas são mais prevalentes que as formas orgânicas, e dentre as formas inorgânicas, o As(V) (arsenato) é menos tóxica e está presente na forma de minerais imóveis, enquanto que o As(III) (arsenito) é mais tóxica e mobilizado na água (Shrivastava et al. 2015).
Em solos anaeróbicos, como os submersos utilizados no cultivo de arroz, a forma predominante é o As(III), pois nessas condições o As(V), forma oxidada de iAs, é reduzido a As(III) (Beans 2021). A captação de As(III) pelas plantas ocorre por membros da família de aquaporinas (nodulin 26-like intrinsic protein – NIP), que também captam silício (Ma et al. 2008). Como o arroz é uma das espécies que mais acumula silício e é cultivado em solo anaeróbico, acumula altos teores de As(III) (Awasthi et al. 2017).
Diferentes estudos têm sido conduzidos para elucidar os mecanismos de resposta a estresses abióticos em plantas, assim como os mecanismos envolvidos na captação, transporte e acúmulo de As. Dentre os avanços obtidos, pode-se destacar o envolvimento do óxido nítrico (NO) na tolerância a diferentes estresses abióticos (Fancy et al. 2017; Cao et al. 2019; Li et al. 2019; Sánchez-Vicente e Lorenzo 2021; Tewari et al. 2021) e na redução do acúmulo de As (Singh et al. 2016).
A síntese de NO em plantas não está completamente elucidada, mas sabe-se que ocorre a partir de duas rotas principais, uma de redução (redução de nitrito a NO) e uma de oxidação (oxidação de moléculas aminadas). Na planta, a redução do nitrito a NO pode ocorrer pelas vias não enzimática e enzimática (Astier et al. 2018). A redução do nitrito a NO pela via não enzimática é rara e ocorre em situações muito particulares, de baixo pH, ambiente com alto poder redutor e quantidades elevadas de nitrato (Bethke et al. 2004). A redução do nitrito a NO pela via enzimática envolve as enzimas nitrato redutase (NR), nitrito:NO redutase (Ni-NOR) (NR específicas de membrana das raízes) e xantina oxidase (XOR-like) (Tewari et al. 2021). A enzima NR reduz nitrato a nitrito e também catalisa a transferência de elétrons de NAD(P)H para nitrito, formando NO. As enzimas Ni-NOR convertem nitrito a NO usando como doador de elétrons NAD(P)H. A enzima XOR também é capaz de reduzir nitrato orgânico, nitrato inorgânico e nitrito, liberando NO (Procházková e Pavlíková 2014; Astier et al. 2018).
Há muitas evidências que produção de NO a partir da oxidação em plantas é similar ao descrito para animais. Em animais, enzima oxido nítrico sintase (NOS) catalisa a formação de NO e L-citrolina a partir de L-arginina por meio de mono-oxigenação dupla (Astier et al. 2018). No entanto, ainda não foram identificados homólogos dos genes NOS em plantas superiores, apenas em algas verdes. Como um grande número de estudos foi desenvolvido em plantas superiores, e homólogos de NOS nunca foram detectados, existe a hipótese de ausência de NOS nessas espécies. Outros estudos sugerem a existência de uma rota alternativa de síntese de NO via oxidação, com atividade semelhante à NOS, denominada NOS-like (atuação de outros genes, diferentes de NOS) (Astier et al. 2018).
Como mencionado, o NO parece estar envolvido com a tolerância a estresses abióticos e no metabolismo do As em plantas. No entanto, a dinâmica do NO em arroz sob condição de estresse e no acúmulo de As não está clara. Nesse sentido, a hipótese desse estudo é que a tolerância a estresses abióticos de algumas cultivares de arroz, assim como o menor acúmulo de As, são decorrentes da maior síntese de NO nessas cultivares sob essas condições.
A quantificação de NO é muito difícil pois é uma molécula gasosa, de meia vida curta, e com interferência de vários metabólitos (Vishwakarma et al. 2019). Mas mesmo assim, alguns métodos de detecção têm sido utilizados, como o descrito por Zhou et al. (2005). Quando uma molécula é de difícil mensuração, pode-se fazer a sua análise de forma indireta, ou seja, analisando a expressão dos genes (ou atividade das enzimas) envolvidos na sua síntese. Um exemplo é o etileno (fitohormônio gasoso), no qual a análise de expressão dos genes ACC oxidase e ACC sintase é um indicativo da quantidade desse fitohormônio nos tecidos (Vong et al. 2019; Soares et al. 2021). Nesse sentido, a caracterização de genes envolvidos na síntese de NO pode ser uma alternativa útil para elucidar de forma indireta a participação do NO na tolerância a estresses. Além disso, a caracterização desses genes pode ser favorável para o desenvolvimento de novos genótipos de arroz com maior capacidade de lidar com estresses abióticos e As.
Metodologia
Material vegetal
Experimento 1
Para germinação e obtenção de plântulas, sementes de arroz das cultivares BRS Pampa (sensível à salinidade) e BRS Bojuru (tolerante à salinidade) serão desinfestadas com hipoclorito de sódio (2,5%), dispostas em papel Germitest® umedecido com água destilada (2,5x o peso do papel) e acondicionadas em câmara de crescimento com 16h de luz, a 25ºC, durante 7 dias (Brasil, 2009). Posteriormente, as plântulas de arroz de ambas as cultivares serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida (1976), e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 3 dias para aclimatação. Após esse período, as plântulas serão conduzidas como segue: A – Controle: plântulas das cultivares BRS Pampa e BRS Bojuru serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias; B – Salinidade: plântulas das cultivares BRS Pampa e BRS Bojuru serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida acrescida de 40mM de NaCl, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias. O experimento será conduzido em câmaras de crescimento, em delineamento de blocos ao acaso, com três replicadas biológicas, compostas por 50 plântulas cada. Após o período de 5 dias nas diferentes condições, parte das plântulas será avaliada quanto aos caracteres morfológicos comprimento de parte aérea, comprimento de raiz, peso seco de parte aérea e peso seco de raiz. As demais plântulas serão divididas em parte aérea e raiz, e parte do tecido será fixada com N líquido e armazenada em ultrafreezer até o momento da extração de RNA. O restante do tecido será utilizado para quantificação de óxido nítrico.
Experimento 2
Para germinação e obtenção de plântulas, sementes de arroz das cultivares BRS Pampa (sensível à baixa temperatura) e BRS Bojuru (tolerante à baixa temperatura) serão desinfestadas com hipoclorito de sódio (2,5%), dispostas em papel Germitest® umedecido com água destilada (2,5x o peso do papel) e acondicionadas em câmara de crescimento com 16h de luz, a 25ºC, durante 7 dias (Brasil, 2009). Posteriormente, as plântulas de arroz de ambas as cultivares serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida (1976), e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 3 dias para aclimatação. Após esse período, as plântulas serão conduzidas como segue: A – Controle: plântulas das cultivares BRS Pampa e BRS Bojuru serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias; B – Baixas temperaturas: plântulas das cultivares BRS Pampa e BRS Bojuru serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida, e mantidas a 13ºC e 16h de luz, durante 5 dias. O experimento será conduzido em câmaras de crescimento, em delineamento de blocos ao acaso, com três replicadas biológicas, compostas por 50 plântulas cada. Após o período de 5 dias nas diferentes condições, parte das plântulas será avaliada quanto aos caracteres morfológicos comprimento de parte aérea, comprimento de raiz, peso seco de parte aérea e peso seco de raiz. As demais plântulas serão divididas em parte aérea e raiz, e parte do tecido será fixada com N líquido e armazenada em ultrafreezer até o momento da extração de RNA. O restante do tecido será utilizado para quantificação de óxido nítrico.
Experimento 3
Para germinação e obtenção de plântulas, sementes de arroz das cultivares BR IRGA 409 (sensível a toxidez por Fe) e Epagri 108 (tolerante a toxidez por Fe) serão desinfestadas com hipoclorito de sódio (2,5%), dispostas em papel Germitest® umedecido com água destilada (2,5x o peso do papel) e acondicionadas em câmara de crescimento com 16h de luz, a 25ºC, durante 7 dias (Brasil, 2009). Posteriormente, as plântulas de arroz de ambas as cultivares serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida (1976), e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 3 dias para aclimatação. Após esse período, as plântulas serão conduzidas como segue: A – Controle: plântulas das cultivares BR IRGA 409 e Epagri 108 serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias; B – Toxidez por Fe: plântulas das cultivares BR IRGA 409 e Epagri 108 serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida acrescida de 300 mg L-1 de FeSO4⋅7H2O, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias.
Os experimentos serão conduzidos em câmaras de crescimento, em delineamento de blocos ao acaso, com três replicadas biológicas, compostas por 50 plântulas cada. Após o período de 5 dias nas diferentes condições, parte das plântulas será avaliada quanto aos caracteres morfológicos comprimento de parte aérea, comprimento de raiz, peso seco de parte aérea e peso seco de raiz. As demais plântulas serão divididas em parte aérea e raiz, e parte do tecido será fixada com N líquido e armazenada em ultrafreezer até o momento da extração de RNA. O restante do tecido será utilizado para quantificação de óxido nítrico.
Experimento 4
Sementes das cultivares Epagri 108 (menor acúmulo de As no grão) e Nowrin Mochi (maior acúmulo de As no grão) serão semeadas em baldes e mantidas em casa de vegetação, conforme segue: A – Controle: semeadura em baldes contendo solo da região de cultivo de arroz irrigado; B – As: semeadura em baldes contendo solo com alto teor de As. As plantas serão cultivadas com lâmina de água, e atendendo as demais recomendações de manejo da cultura. O experimento será conduzindo em delineamento inteiramente casualizado, com três replicadas biológicas, compostas por 5 plantas cada. Serão feitas coletas de tecido de panícula 8 e 16 dias após a antese. Esses tecidos serão fixados com N líquido e armazenados em ultrafreezer até o momento da extração de RNA. Além disso, esses tecidos serão utilizados para quantificação de óxido nítrico. Na colheita, os grãos serão caracterizados quanto ao acúmulo de As no grão.
Extração de RNA e síntese de cDNA
Para extração de RNA será utilizado o um tampão de extração comercial, obedecendo as recomendações do fabricante. A quantidade e qualidade (pureza) do RNA será acessada utilizando espectrofotômetro Nanovue e a integridade do RNA será avaliada em gel de agarose 1%. Na sequência, 1μg de RNA será submetido a digestão de DNAs contaminantes utilizando a enzima DNAse. Após avaliar a eficiência da digestão do DNA via PCR, o RNA será convertido em cDNA utilizado o kit comercial SuperScript® III first-strand system for RT-PCR, com primer oligo-dT, enzima transcriptase reversa e demais reagentes necessários.
Perfil transcricional
Será avaliado o perfil transcricional dos genes envolvidos na síntese de óxido nítrico em plantas. As sequências correspondentes a região codificadora de cada gene serão obtidas no banco de dados de arroz RAP-DB (Rice Annotation Project Database – https://rapdb.dna.affrc.go.jp/). Os primers serão desenhados utilizando o programa Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi), obedecendo aos seguintes parâmetros: fragmento amplificado com tamanho de 50-150pb, temperatura de anelamento ~60ºC, conteúdo de GC de 40-60%.
A análise de expressão via PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) será conduzida de acordo com o manual MIQE (Bustin et al. 2009) utilizando equipamento 7500 fast real-time PCR system (Applied Biosystems). A validação buscando determinar a eficiência de amplificação e a especificidade de cada primer será realizada utilizando cinco diluições de cDNA. Serão utilizados apenas os primers que apresentarem eficiência de 90 a 110% e com apenas um pico na curva de dissociação (específicos). Os ensaios de expressão gênica serão conduzidos utilizando o corante SYBR Green mix. Três replicatas biológicas independentes de cada amostra e três replicatas técnicas de cada replicata biológica serão utilizadas para a análise em RT-qPCR. A quantificação será conduzida de acordo com o método ΔΔCt (Livak e Schmittgen 2001).
Além dos primers correspondentes aos genes alvo (síntese de óxido nítrico), serão testados cinco primers de genes de referência/normalizadores e os dados de expressão serão submetidos à análise de estabilidade no programa DataAssist™ v3.0 Software. Após análise os três genes que apresentarem valores de score abaixo de 1 serão utilizados para normalizar os dados de expressão dos genes alvo.
Quantificação de As em grãos
Após a colheita, os grãos serão descascados e polidos, e posteriormente moídos para obtenção da farinha. As amostras de farinha serão enviadas para Universidade Federal do ABC (Santo André – SP), onde será feita digestão e em seguida a quantificação de As em equipamento espectrômetro de massa de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS Agilent 7900), conforme descrito em Oliveira et al. (2021).
Quantificação de NO
Os tecidos serão coletados e imediatamente processados. A coleta para análise de NO será feita no mesmo dia da coleta para análise de expressão gênica. A quantificação de NO será feita conforme descrito por Zhou et al. (2005), utilizando carvão e os reagentes tampão ácido acético (pH 3.6, contendo 4% de diacetato de zinco) e o reagente Griess. A leitura dos extratos será feita em espectrofotômetro em 540nm. Para estimar o conteúdo de NO será feita uma curva padrão utilizando NaNO2.
Experimento 1
Para germinação e obtenção de plântulas, sementes de arroz das cultivares BRS Pampa (sensível à salinidade) e BRS Bojuru (tolerante à salinidade) serão desinfestadas com hipoclorito de sódio (2,5%), dispostas em papel Germitest® umedecido com água destilada (2,5x o peso do papel) e acondicionadas em câmara de crescimento com 16h de luz, a 25ºC, durante 7 dias (Brasil, 2009). Posteriormente, as plântulas de arroz de ambas as cultivares serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida (1976), e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 3 dias para aclimatação. Após esse período, as plântulas serão conduzidas como segue: A – Controle: plântulas das cultivares BRS Pampa e BRS Bojuru serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias; B – Salinidade: plântulas das cultivares BRS Pampa e BRS Bojuru serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida acrescida de 40mM de NaCl, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias. O experimento será conduzido em câmaras de crescimento, em delineamento de blocos ao acaso, com três replicadas biológicas, compostas por 50 plântulas cada. Após o período de 5 dias nas diferentes condições, parte das plântulas será avaliada quanto aos caracteres morfológicos comprimento de parte aérea, comprimento de raiz, peso seco de parte aérea e peso seco de raiz. As demais plântulas serão divididas em parte aérea e raiz, e parte do tecido será fixada com N líquido e armazenada em ultrafreezer até o momento da extração de RNA. O restante do tecido será utilizado para quantificação de óxido nítrico.
Experimento 2
Para germinação e obtenção de plântulas, sementes de arroz das cultivares BRS Pampa (sensível à baixa temperatura) e BRS Bojuru (tolerante à baixa temperatura) serão desinfestadas com hipoclorito de sódio (2,5%), dispostas em papel Germitest® umedecido com água destilada (2,5x o peso do papel) e acondicionadas em câmara de crescimento com 16h de luz, a 25ºC, durante 7 dias (Brasil, 2009). Posteriormente, as plântulas de arroz de ambas as cultivares serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida (1976), e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 3 dias para aclimatação. Após esse período, as plântulas serão conduzidas como segue: A – Controle: plântulas das cultivares BRS Pampa e BRS Bojuru serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias; B – Baixas temperaturas: plântulas das cultivares BRS Pampa e BRS Bojuru serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida, e mantidas a 13ºC e 16h de luz, durante 5 dias. O experimento será conduzido em câmaras de crescimento, em delineamento de blocos ao acaso, com três replicadas biológicas, compostas por 50 plântulas cada. Após o período de 5 dias nas diferentes condições, parte das plântulas será avaliada quanto aos caracteres morfológicos comprimento de parte aérea, comprimento de raiz, peso seco de parte aérea e peso seco de raiz. As demais plântulas serão divididas em parte aérea e raiz, e parte do tecido será fixada com N líquido e armazenada em ultrafreezer até o momento da extração de RNA. O restante do tecido será utilizado para quantificação de óxido nítrico.
Experimento 3
Para germinação e obtenção de plântulas, sementes de arroz das cultivares BR IRGA 409 (sensível a toxidez por Fe) e Epagri 108 (tolerante a toxidez por Fe) serão desinfestadas com hipoclorito de sódio (2,5%), dispostas em papel Germitest® umedecido com água destilada (2,5x o peso do papel) e acondicionadas em câmara de crescimento com 16h de luz, a 25ºC, durante 7 dias (Brasil, 2009). Posteriormente, as plântulas de arroz de ambas as cultivares serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida (1976), e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 3 dias para aclimatação. Após esse período, as plântulas serão conduzidas como segue: A – Controle: plântulas das cultivares BR IRGA 409 e Epagri 108 serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias; B – Toxidez por Fe: plântulas das cultivares BR IRGA 409 e Epagri 108 serão transferidas para recipientes (750 mL) contendo solução hidropônica de Yoshida acrescida de 300 mg L-1 de FeSO4⋅7H2O, e mantidas a 25ºC e 16h de luz, durante 5 dias.
Os experimentos serão conduzidos em câmaras de crescimento, em delineamento de blocos ao acaso, com três replicadas biológicas, compostas por 50 plântulas cada. Após o período de 5 dias nas diferentes condições, parte das plântulas será avaliada quanto aos caracteres morfológicos comprimento de parte aérea, comprimento de raiz, peso seco de parte aérea e peso seco de raiz. As demais plântulas serão divididas em parte aérea e raiz, e parte do tecido será fixada com N líquido e armazenada em ultrafreezer até o momento da extração de RNA. O restante do tecido será utilizado para quantificação de óxido nítrico.
Experimento 4
Sementes das cultivares Epagri 108 (menor acúmulo de As no grão) e Nowrin Mochi (maior acúmulo de As no grão) serão semeadas em baldes e mantidas em casa de vegetação, conforme segue: A – Controle: semeadura em baldes contendo solo da região de cultivo de arroz irrigado; B – As: semeadura em baldes contendo solo com alto teor de As. As plantas serão cultivadas com lâmina de água, e atendendo as demais recomendações de manejo da cultura. O experimento será conduzindo em delineamento inteiramente casualizado, com três replicadas biológicas, compostas por 5 plantas cada. Serão feitas coletas de tecido de panícula 8 e 16 dias após a antese. Esses tecidos serão fixados com N líquido e armazenados em ultrafreezer até o momento da extração de RNA. Além disso, esses tecidos serão utilizados para quantificação de óxido nítrico. Na colheita, os grãos serão caracterizados quanto ao acúmulo de As no grão.
Extração de RNA e síntese de cDNA
Para extração de RNA será utilizado o um tampão de extração comercial, obedecendo as recomendações do fabricante. A quantidade e qualidade (pureza) do RNA será acessada utilizando espectrofotômetro Nanovue e a integridade do RNA será avaliada em gel de agarose 1%. Na sequência, 1μg de RNA será submetido a digestão de DNAs contaminantes utilizando a enzima DNAse. Após avaliar a eficiência da digestão do DNA via PCR, o RNA será convertido em cDNA utilizado o kit comercial SuperScript® III first-strand system for RT-PCR, com primer oligo-dT, enzima transcriptase reversa e demais reagentes necessários.
Perfil transcricional
Será avaliado o perfil transcricional dos genes envolvidos na síntese de óxido nítrico em plantas. As sequências correspondentes a região codificadora de cada gene serão obtidas no banco de dados de arroz RAP-DB (Rice Annotation Project Database – https://rapdb.dna.affrc.go.jp/). Os primers serão desenhados utilizando o programa Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi), obedecendo aos seguintes parâmetros: fragmento amplificado com tamanho de 50-150pb, temperatura de anelamento ~60ºC, conteúdo de GC de 40-60%.
A análise de expressão via PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) será conduzida de acordo com o manual MIQE (Bustin et al. 2009) utilizando equipamento 7500 fast real-time PCR system (Applied Biosystems). A validação buscando determinar a eficiência de amplificação e a especificidade de cada primer será realizada utilizando cinco diluições de cDNA. Serão utilizados apenas os primers que apresentarem eficiência de 90 a 110% e com apenas um pico na curva de dissociação (específicos). Os ensaios de expressão gênica serão conduzidos utilizando o corante SYBR Green mix. Três replicatas biológicas independentes de cada amostra e três replicatas técnicas de cada replicata biológica serão utilizadas para a análise em RT-qPCR. A quantificação será conduzida de acordo com o método ΔΔCt (Livak e Schmittgen 2001).
Além dos primers correspondentes aos genes alvo (síntese de óxido nítrico), serão testados cinco primers de genes de referência/normalizadores e os dados de expressão serão submetidos à análise de estabilidade no programa DataAssist™ v3.0 Software. Após análise os três genes que apresentarem valores de score abaixo de 1 serão utilizados para normalizar os dados de expressão dos genes alvo.
Quantificação de As em grãos
Após a colheita, os grãos serão descascados e polidos, e posteriormente moídos para obtenção da farinha. As amostras de farinha serão enviadas para Universidade Federal do ABC (Santo André – SP), onde será feita digestão e em seguida a quantificação de As em equipamento espectrômetro de massa de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS Agilent 7900), conforme descrito em Oliveira et al. (2021).
Quantificação de NO
Os tecidos serão coletados e imediatamente processados. A coleta para análise de NO será feita no mesmo dia da coleta para análise de expressão gênica. A quantificação de NO será feita conforme descrito por Zhou et al. (2005), utilizando carvão e os reagentes tampão ácido acético (pH 3.6, contendo 4% de diacetato de zinco) e o reagente Griess. A leitura dos extratos será feita em espectrofotômetro em 540nm. Para estimar o conteúdo de NO será feita uma curva padrão utilizando NaNO2.
Indicadores, Metas e Resultados
Metas:
Identificar no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em arroz (Oryza sativa L.) – até maio de 2022.
Obter o perfil transcricional de no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em cultivares de arroz sensível e tolerante, submetidas à salinidade durante as fases iniciais de desenvolvimento – até dezembro de 2022.
Obter o perfil transcricional de no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em cultivares de arroz sensível e tolerante, submetidas à baixas temperaturas durante as fases iniciais de desenvolvimento – até abril de 2023.
Obter o perfil transcricional de no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em cultivares de arroz sensível e tolerante, submetidas à toxidez por Fe durante as fases iniciais de desenvolvimento – até agosto de 2023.
Obter o perfil transcricional de no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em cultivares de arroz com maior e menor acúmulo de As crescidas em solo com alto teor de As – até junho de 2024.
Estabelecer a relação entre o acúmulo de transcritos de pelo menos três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico e a tolerância a salinidade, baixas temperaturas, toxidez por excesso de Fe e acúmulo de As arroz – até julho de 2024.
Publicar no mínimo um artigo científico em revista com alto fator de impacto – até dezembro de 2024.
Resultados esperados:
Com esse estudo espera-se esclarecer se há um envolvimento dos genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico (NO) e a tolerância a estresses por baixas temperaturas, salinidade e toxidez por Fe, e acúmulo de As em arroz. Além disso, espera-se apresentar o uso de análise de expressão como método indireto de detecção de NO. O envolvimento do NO na tolerância a estresses abióticos e no acúmulo de As em arroz tem sido abordado em alguns estudos, no entanto, o comportamento dos genes envolvidos na síntese dessa molécula ainda não foi analisado nessas condições. Apesar dos indícios da atuação NO nos mecanismos de tolerância e no acúmulo de As, há muitas lacunas que precisam ser elucidas. Por exemplo: Há produção de NO nessas condições? O NO é produzido pela via de redução (enzimática) ou por uma via de oxidação? Assim, os resultados obtidos nesse estudo serão inovadores e de grande impacto, pois será possível contribuir com o conhecimento acerca da síntese de NO durante estresses abióticos e acúmulo de As em arroz, e identificar genes chave com uso potencial no melhoramento de arroz via tecnologias modernas. Além do impacto científico, espera-se com essa proposta a formação de recursos humanos, já que as atividades serão executadas com auxílio de aluno doutorado e de iniciação científica. Ainda, os resultados obtidos serão divulgados para o meio acadêmico, científico e técnico a partir de uma publicação em revista de fator de impacto relevante e em congressos científicos.
Identificar no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em arroz (Oryza sativa L.) – até maio de 2022.
Obter o perfil transcricional de no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em cultivares de arroz sensível e tolerante, submetidas à salinidade durante as fases iniciais de desenvolvimento – até dezembro de 2022.
Obter o perfil transcricional de no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em cultivares de arroz sensível e tolerante, submetidas à baixas temperaturas durante as fases iniciais de desenvolvimento – até abril de 2023.
Obter o perfil transcricional de no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em cultivares de arroz sensível e tolerante, submetidas à toxidez por Fe durante as fases iniciais de desenvolvimento – até agosto de 2023.
Obter o perfil transcricional de no mínimo três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico em cultivares de arroz com maior e menor acúmulo de As crescidas em solo com alto teor de As – até junho de 2024.
Estabelecer a relação entre o acúmulo de transcritos de pelo menos três genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico e a tolerância a salinidade, baixas temperaturas, toxidez por excesso de Fe e acúmulo de As arroz – até julho de 2024.
Publicar no mínimo um artigo científico em revista com alto fator de impacto – até dezembro de 2024.
Resultados esperados:
Com esse estudo espera-se esclarecer se há um envolvimento dos genes responsáveis pela síntese de óxido nítrico (NO) e a tolerância a estresses por baixas temperaturas, salinidade e toxidez por Fe, e acúmulo de As em arroz. Além disso, espera-se apresentar o uso de análise de expressão como método indireto de detecção de NO. O envolvimento do NO na tolerância a estresses abióticos e no acúmulo de As em arroz tem sido abordado em alguns estudos, no entanto, o comportamento dos genes envolvidos na síntese dessa molécula ainda não foi analisado nessas condições. Apesar dos indícios da atuação NO nos mecanismos de tolerância e no acúmulo de As, há muitas lacunas que precisam ser elucidas. Por exemplo: Há produção de NO nessas condições? O NO é produzido pela via de redução (enzimática) ou por uma via de oxidação? Assim, os resultados obtidos nesse estudo serão inovadores e de grande impacto, pois será possível contribuir com o conhecimento acerca da síntese de NO durante estresses abióticos e acúmulo de As em arroz, e identificar genes chave com uso potencial no melhoramento de arroz via tecnologias modernas. Além do impacto científico, espera-se com essa proposta a formação de recursos humanos, já que as atividades serão executadas com auxílio de aluno doutorado e de iniciação científica. Ainda, os resultados obtidos serão divulgados para o meio acadêmico, científico e técnico a partir de uma publicação em revista de fator de impacto relevante e em congressos científicos.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| AGUIAR AFONSO MARIANO | |||
| ANDRÉS ELOY CHACÓN ORTIZ | |||
| ANTONIO COSTA DE OLIVEIRA | 1 | ||
| ANTÔNIO DE AZEVEDO PERLEBERG | |||
| ARIANO MARTINS DE MAGALHÃES JUNIOR | |||
| BRUNO LEMOS BATISTA | |||
| CAMILA PEGORARO | 3 | ||
| Flávia Lopes Solari | |||
| LATÓIA EDUARDA MALTZAHN | |||
| LUCA LORETO CYRIACO | |||
| LUCIANO CARLOS DA MAIA | 2 | ||
| LUIS HERMINIO CHAIREZ TEJEDA | |||
| SABRINA SPIERING PASSOS | |||
| VICTORIA FREITAS DE OLIVEIRA |