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A variação cromossômica encontrada nas aves torna esse grupo ideal para investigarmos os mecanismos evolutivos responsáveis tanto pela reorganização, quanto pela conservação cariotípica. Assim, o desenvolvimento desse projeto irá contribuir para a compreensão da evolução cromossômica e genômica deste grupo. Para tanto, técnicas de citogenética clássica, molecular e citogenômica serão utilizadas. Essas investigações permitirão abordar questões biológicas importantes, como por exemplo: 1) Organização cromossômica; 2) Variações cromossômicas entre espécies e populações; 3) Papel dos rearranjos cromossômicos na especiação, e; 4) Papel das sequências repetitivas na organização cromossômica.

METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO
MATERIAL: As amostras serão coletadas de acordo com a licença SISBIO nº 81564-1. As amostragens serão de espécies ex situ, do Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre (NURFS) (UFPEL/Pelotas), e Centro de Triagem de Animais Silvestres (CETAS) (UFPEL/Pelotas), que virão a óbito ou terão que ser sacrificados devido às condições clínicas que impeçam sua recuperação.

MÉTODOS
Preparações cromossômicas: Para cada indivíduo amostrado será coletada uma amostra de tecido (pele, órgãos, e/ou pena em crescimento) para o estabelecimento da cultura celular e obtenção de cromossomos segundo Sasaki et al. (1968), com modificações. Cultura direta de medula óssea também poderá ser utilizada, seguindo o protocolo de Garnero e Gunski (2000). Cromossomos em metáfases serão obtidos através do tratamento com colchicina (1 hora), solução hipotônica (15 minutos) e a fixação em metanol e ácido acético (3:1).

Descrição cariotípica e bandeamentos cromossômicos: A descrição cariotípica (número diploide e morfologias cromossômicas) de cada amostra será realizada através da análise de pelo menos 40 metáfases coradas com Giemsa 10% em tampão fosfato 0.07 M (pH 6.8), durante 5 minutos. A posição do centrômero será definida segundo Guerra (1986). As melhores metáfases de cada exemplar serão fotografadas para a montagem do cariótipo com o software Corel PHOTO-PAINT™ 2021. Para a identificação das regiões ricas em heterocromatina constitutiva (bandas C) será utilizado o protocolo de Fernández et al., (2002) ou Ledesma et al., (2002). No primeiro protocolo as lâminas serão envelhecidas por 48 horas a 65 ºC e o Bandeamento C será realizado sob a presença de formamida (50%) e coradas com solução de Giemsa 10 % de 15 a 30 min. No segundo protocolo o bandeamento cromossômico será obtido sob a presença de Hidróxido de Bário. A identificação da atividade transcricional das regiões organizadoras de nucléolo (NOR’s) será realizada mediante o protocolo de Howell e Black 1980. Para tanto, as lâminas serão tratadas com uma solução coloidal, juntamente com nitrato de prata (NO3Ag) a 60 º C. O bandeamento G será realizado de acordo com Seabright 1971. Primeiramente as lâminas serão envelhecidas por 5 dias (temperatura ambiente) e tratadas com tripsina (0,1%) a 37°C e coradas com Giemsa 10% em tampão fosfato 0.07 M (pH 6.8) durante 5 minutos.

Hibridização in situ fluorescente (FISH): Serão utilizados diferentes tipos de sondas nos experimentos de FISH, marcadas por DOP-PCR ou Nick translation. As sondas utilizadas serão cromossomo-específicas, correspondendo aos cromossomos de 1 a 10 de G. gallus e/ou de Zenaida auriculata (Kretschmer et al., 2018), sondas de rDNA 18/28s, telomérica, sequências de microssatélites e satélites. Os protocolos utilizando sondas cromossomo-específicas serão realizados de acordo com de Oliveira et al. (2010) e os protocolos com sequências repetitivas serão realizados seguindo Yano et al. (2017).

Caracterização dos Satelitomas: Alguns representantes de Aves serão selecionados para análises de Satelitoma. Para estas espécies, os DNAs genômicos (gDNA) de machos e fêmeas serão extraídos e sequenciados utilizando a plataforma Illumina HiSeq4000 (paired-end 2x150bp). Assim, o gDNA de ambas as amostras será sequenciado utilizando serviços de sequenciamento por demanda, com cobertura aproximada de 2Gb por amostra (cobertura de 2x), atendendo de forma bastante satisfatória a cobertura de 1x, tipicamente utilizada na montagem de satelitomas (Ruiz-Ruano et al. 2016; Utsunomia et al. 2019). A caracterização dos satelitomas será realizada utilizando o software RepeatExplorer (Novák et al. 2013), em associação com um conjunto de ferramentas denominado satMiner (Ruiz-Ruano et al. 2016), basicamente consistindo em diferentes passos resumidamente assim descritos: i) preparação dos reads para RepeatExplorer, já com os cortes nos adaptadores e seleção de qualidade; ii) execução do software RepeatExplorer com a opção padrão; iii) seleção dos clusters que apresentam a forma de gráficos de DNAs satélites (forma em anel ou cilíndrica); iv) montagem de uma base de dados customizada com os satélites já isolados e utilização de um script (deconseq_run.py) para eliminar todas as sequências que apresentarem similaridade com os satélites já isolados das bibliotecas originais; v) seleção de novos reads para uma nova rodada de RepeatExplorer; vi) repetição das etapas (i a v) até a completa ausência de sequências repetidas em tandem. Esta metodologia de alto rendimento permitirá obter um grande conjunto de sequências de DNAs satélites presentes no genoma das espécies analisadas. Deve ser destacado que todo o procedimento acima descrito será aplicado de forma independente em cada uma das bibliotecas sequenciadas. Ao final, diferentes comparações entre as bibliotecas serão possíveis de serem realizadas.
Após a identificação das famílias de DNA satélites, primers serão desenhados e usados para amplificar cada uma das sequências satélites obtidas por intermédio de reações em cadeia da polimerase (PCR). Posteriormente, os produtos de PCR serão checados em géis de agarose 2 % e utilizados para produzir sondas marcadas diferencialmente por nick translation, utilizando Atto488-dUTP ou Atto550-dTUP, conforme as instruções do manual do fabricante. As sondas serão utilizadas para mapear a localização das sequências satélites por hibridização in situ, de acordo com protocolo descrito em Yano et al. (2017).

O andamento do projeto será acompanhado principalmente pelo andamento do cronograma previsto e a partir da análise da divulgação dos resultados em resumos de congressos e artigos científicos publicados.
O projeto tem as seguintes metas:
i) Descrever o cariótipo das espécies coletadas;
ii) Realizar análises comparativas dos padrões de bandeamento C, G, NOR's, e distribuição de sequências repetitivas;
iii) Identificar as homeologias e rearranjos ocorridos ao longo da evolução cromossômica;
iv) Caracterizar o satelitoma de espécies em representantes de aves;
v) Realizar análises comparativas do satelitoma entre esses representantes;
vi) Comparar e analisar os mecanismos e a importância dos DNA satélites.
vii) Publicar pelo menos 5 artigos com os resultados obtidos durante a vigência do projeto

Os resultados obtidos contribuirão para o conhecimento da organização cromossômica, papel, e evolução das sequências satélites em representantes de aves e serão apresentados em congressos nacionais e/ou internacionais, além da publicação em periódicos especializados da área. Espera-se publicar pelo menos cinco artigos científicos com os dados obtidos.
A formação de recursos humanos também será contemplada, considerando que pós-graduandos em nível de mestrado, vinculados ao Programa de Pós-graduação em Biodiversidade Animal da Universidade Federal de Pelotas, poderão estar associados ao projeto, bem como alunos de graduação em estudos de iniciação científica.