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No Brasil, a criação de caprinos e ovinos é uma atividade bastante desenvolvida e em ascensão. O país dispõe de um efetivo de 9.614.722 caprinos e 18.410.551 ovinos, destacando-se as regiões Sul e Nordeste, onde concentram-se o maior número destes animais (PORTO et al., 2013; IBGE, 2015). Apesar deste grande contingente, a maioria destas apresentam baixos índices produtivos, principalmente, de práticas de manejo inadequado e más condições sanitárias, o que se reflete em altas taxas de morbidade (ALENCAR et al., 2010). No aspecto sanitário, as maiores limitações dizem respeito ao deficiente ou ausente controle de enfermidades, dentre estas, é importante destacar a linfadenite caseosa (LC) (FILHO et al., 2006). A LC é uma doença infectocontagiosa, de ocorrência mundial, caracterizada principalmente pelo desenvolvimento de abscessos encapsulados em linfonodos superficiais (LC externa) e viscerais (LC interna) (DORELLA et al., 2009; PATON et al., 2003). O agente etiológico desta enfermidade é Corynebacterium pseudotuberculosis, uma bactéria gram-positiva e intracelular facultativa pleomórfica (D’AFONSECA et al., 2010; DORELLA et al., 2006). Este patógeno é responsável por perdas econômicas decorrentes de sua alta prevalência. Tem-se a redução na produção de leite, carne e lã, além da perda de capacidade reprodutiva e desvalorização da pele dos animais (D’AFONSECA et al., 2008).
C. pseudotuberculosis foi identificada em países como: Austrália, Argentina, Nova Zelândia, África do Sul e Estados Unidos, além de países da Comunidade Européia, Brasil, Chile e Uruguai, se tratando de um micro-organismo cosmopolita (COSTA, 2002). A melhor estratégia para o controle e prevenção da LC, seria a imunoprofilaxia. As vacinas disponíveis no mercado não atingem a proteção e eficiência desejada, além de causarem reações adversas nos animais vacinados (GUIMARÃES et al., 2011). Deste modo, é constante a busca por novos alvos e formulações vacinais.
Um exemplo disso são as vacinas utilizando proteínas recombinantes, as mesmas oferecem uma maior segurança, por serem baseadas em antígenos selecionados (DROPPA-ALMEIDA et al., 2016). Esta estratégia apresentou níveis variados de proteção entre 0-100 % (Silva et al., 2014; Silva et al., 2018; Pinho et al., 2009; Droppa-Almeida et al., 2016). Entretanto, a produção das proteínas recombinantes requer etapas de fermentação, isolamento, purificação, detoxificação, entre outras, tornando o processo muito laborioso e principalmente um custoso para a indústria.
Por outro lado, a estratégia de desenvolver estratégia não purificada necessita de apenas 3 dias para a expressão de proteína e, dispensando as etapas de isolamento e purificação da proteína recombinante, com isso, diminuindo significativamente o tempo e os custos de produção, além de não apresentar riscos quanto a segurança (atóxicas) (MOREIRA et al., 2016). Esta técnica utiliza a previsibilidade de um alvo promissor, que será apresentado na forma não purificada. Estudos também já demonstraram que a estratégia de bacterina recombinante de E. coli, com sua preparação de célula inteira exibe um efeito imunomodulatório (Gupta et al., 2012; Lourdault et al., 2014). A formulação contendo células inativadas tem vantagens adicionais, além do baixo custo de produção em larga escala, a bactéria contém fatores que estimulam células apresentadoras de antígenos (APCs) (Gupta et al., 2012). Esta estratégia já se mostrou capaz de ser imunogênica, induzindo níveis semelhantes de imunoglobulinas à proteínas purificadas, em ensaios de ELISA e bioneutralização (de Oliveira et al., 2017; Moreira et al., 2018). Este estudo visa avaliar a utilização de proteínas recombinantes não purificadas e purificadas, como imunógeno vacinal para profilaxia da LC, avaliando a proteção e respostas imunológicas humoral e celular induzidas pela formulação em camundongos vacinados, buscando uma vacina efetiva para a doença.

Cepas e condições de cultivo: Foram utilizadas duas cepas da bactéria Escherichia coli, BL21 (DE3) STAR e DH5α, cultivadas em meio LB (Luria-Bertani), e quando necessário em sua forma sólida (adicionado de 1,5% de Ágar para uso bacteriológico), podendo ser suplementado com o antibiótico ampicilina (100 mg/mL) quando necessário. A cepa patogênica de C. pseudotuberculosis MIC-6 foi cultivada em caldo Brain and Heart Infusion Broth (BHI-caldo Acumedia) ou BHI-Ágar a 37ºC por 48 h, sob agitação.

Expressão das proteínas rPLD, rCP01850, rPknG, rNanH, rCP40, rCP1957 em Escherichia coli:A transformação da cepa BL21 (DE3) STAR de E. coli, utilizando os plasmídeos previamente construídos pAE/cp01850 ou pAE/pld foi realizada por meio da técnica de choque térmico, como previamente descrito por Rezende e colaboradores (2016). O produto da transformação semeado em meio LB sólido contendo ampicilina, para selecionar apenas colônias recombinantes, e incubadas a 37ºC por 16 h. Para a indução das expressão da proteínas proteínas rPLD, rCP01850, rPknG, rNanH, rCP40, rCP1957 um inóculo contendo 500 mL de LB líquido e 500 μL de ampicilina, permanecendo sob agitação por aproximadamente 2 h a 37ºC. A indução da expressão da será realizada com 1 mM de IPTG por 3 h a 37°C em agitador orbital. As proteínas recombinantes serão purificadas utilizando coluna de cromatografia por afinidade HisTrapTM HP (GE Healthcare).

Produção das bacterinas recombinantes, Inativação da bacterina de E. coli recombinante: Os cultivos de E. coli transformados com o plasmídeo pAE, pAE/cp01850 ou pAE/pld induzidos foram centrifugados a 7.000 × g por 10 min e seu pellet suspendido em 30 mL de PBS 1X (Tampão Salino Fosfato) estéril. Após, foi adicionado diferentes concentrações de formaldeído (0,2-0,8%) ao cultivo em PBS para a inativação da bactéria, permanecendo sob agitação por 16 ou 24 h a uma temperatura de 37ºC. Em seguida, foi realizada uma nova centrifugação a 7.000 × g por 10 min e o pellet lavado por 3 vezes com PBS 1X estéril para remover todo o formaldeído remanescente nas células, utilizando o mesmo protocolo de centrifugação já citado. Após as lavagens, as células foram suspendidas em 30 mL de PBS 1X estéril e estocadas a 4ºC até sua utilização.

Confirmação da inativação:A confirmação da inativação das bacterinas de E. coli recombinantes foi realizada através do plaqueamento de 100 μL da suspensão em meio LB sólido e permanecendo incubado por 18 h em estufa a 37ºC, assim, verificando ou não crescimento de colônias nas placas.

Confirmação da presença de DNA por PCR e testes de segurança: Para confirmar a presença de DNA recombinante nas amostras foi realizada a extração de DNA plasmidial através do kit Plasmid Prep Mini Spin® (GE healthcare) do cultivo inativado de E. coli expressando as proteinas proteínas rPLD, rCP01850, rPknG, rNanH, rCP40, rCP1957. O produto das extrações foi utilizado para verificar DNA plasmidial através de eletroforese em gel de agarose 0,8% e utilizados como template à uma reação de PCR utilizando primers específicos. Após, os plasmídeos foram utilizados para transformar a cepa de E. coli BL21 DH5α por eletroporação, onde a inativação do gene de resistência é confirmada pela ausência do crescimento bacteriano após o plaqueamento de 100 µL em meio LB sólido com ampicilina após 24 h. Além disso, uma alíquota da bacterina recombinante foi incubada em meio LB líquido por 30 dias em Shaker a 37ºC e novamente plaqueada para demonstrar a estabilidade da inativação, para posterior utilização nas vacinas. Fazendo com que o processo se torne seguro e compatível com as normas de biossegurança empregadas na produção industrial.

Determinação UFC/mL: Utilizando alíquotas do cultivo de E. coli transformados com os plasmídeos recombinantes ainda ativo, que serão coletadas após a indução, foi realizada a contagem das unidades formadoras de colônia (UFC). Os mesmos foram semeados em diferentes diluições seriadas para a determinação de concentração em UFC/mL. São utilizadas 2 placas de meio LB sólido para cada diluição de cultivo e em duplicata. Com o número de UFC nas placas, é possível determinar a diluição correta para ser utilizada na formulação das vacinas, utilizando as células recombinantes inativadas.

Avaliação da expressão da proteína proteínas rPLD, rCP01850, rPknG, rNanH, rCP40, rCP1957 por Western blot: Para o WB foi realizada uma eletro-transferência das proteínas presentes nas amostras do gel SDS-PAGE 12% para a membrana de nitrocelulose. Após a transferência, a membrana foi bloqueada com solução de PBS-leite em pó (5%) por 16 h a 4ºC. Em seguida, a membrana é lavada três vezes com PBS-T (0,05% Tween) com 30 s de agitação cada, e posteriormente, adicionado o anticorpo monoclonal anti-6Xhistidina (Sigma Aldrich) na diluição de 1:4000 em PBS-T, por 1 h a temperatura ambiente sob leve agitação, após será adicionado o anticorpo anti-camundongo conjugado com peroxidase (Sigma Aldrich) na diluição de 1:4000 em PBS-T 0,05%. Por fim, as bandas reativas serão reveladas utilizando solução reveladora baseada em 3,3 '-tetrahidrocloreto (DAB) e H2O2.

Determinação da dose letal 50 (DL50):Foi determinada a dose mínima do agente (cepa MIC-6 de Corynebacterium pseudotuberculosis) requerida para indução da infecção, manifestação dos sinais clínicos e patologia da doença em camundongos. Para o cálculo da dose letal, um grupo de seis camundongos BALB/c fêmeas, foi infectado intraperitonealmente com doses seriadas. Então avaliada qual diluição levou 50% dos camundongos a óbito, a qual foi denominada DL50, e então utilizada 2x a DL50 nos experimentos de desafio.

Experimentos de imunização e desafio: Para os experimentos de imunização e desafio serão utlizadas camundongos Balb/c fêmeas, de 6 a 8 semanas de idade, alocados em 15 grupos de 10 animais. A condução do experimento foi aprovada pela comissão de ética em experimentação animal da Universidade Federal de Pelotas (CEEA/UFPel) sob o número 2231-209. Os animais foram distribuídos nos seguintes grupos vacinais:

Embora existam vacinas (bacterinas) comerciais para o controle da doença, as mesmas não são produzidas no Brasil e apresentam um elevado custo de produção. Desta forma, o desenvolvimento de alternativas para a profilaxia da LC é fundamental para a melhoria da sanidade dos rebanhos ovinos. Potenciais antígenos já identificados estão sendo testados em diferentes sistemas, no entanto apresentaram somente proteção parcial. Com o uso de uma vacina baseada em bacterina recombinante expressando antígenos de C. pseudotuberculosis pode possibilitar um incremento na resposta imune e elevada taxa de sobrevida dos animais experimentais além de possibilitar o desenvolvimento de uma vacina de menor custo ao mercado. A realização deste projeto possibilitará um grande avanço na busca de novas estratégias, produtos e alternativas, para o controle da principal doença infecciosa de ovinos, a qual tem um impacto econômico importante para todo o País..
O desenvolvimento desse um novo produto pode ser implementado no setor produtivo. Se verificada a eficácia da vacina ela poderá ser produzida em escala comercial por uma empresa incubada na universidade, ou mesmo a patente obtida pela instituição onde foi desenvolvida poderá ser negociada com empresas que passem produzir essa vacina.
Além disso, este projeto fará parte de uma dissertação de mestrado e uma tese de doutorado. Possibilitará também o treinamento de alunos de graduação (dois bolsistas de iniciação científica). Espera-se gerar pelo menos 4 artigos científicos que possam ser veiculados em periódicos de circulação internacional. Além disso, possibilitará a divulgação dos resultados em congressos científicos (Congresso de Iniciação Científica, Congresso de Microbiologia, Congresso de Genética e Congresso de Imunologia).
Se a hipótese apresentada se mostrar verdadeira, o estudo gerará pelo menos uma patente, e há ainda a expectativa de obtenção de um produto biotecnológico com potencial para transferência desta tecnologia ao setor produtivo.