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O acentuado crescimento do comércio mundial de commodities agrícolas impulsionou o uso de agrotóxicos. Os herbicidas a base de glifosato são os mais utilizados no mundo. Vários autores relatam os efeitos dos herbicidas a base de glifosato, como o Roundup, em animais, causando desregulação endócrina, estresse oxidativo e reduzindo a fertilidade. Um dos mecanismos de toxicidade mais relatados na literatura é o aumento da geração de espécies reativas de oxigênio que apresenta forte correlação com distúrbios neurofisiológicos. A Drosophila melanogaster tem sido a escolha de muitos pesquisadores por ter um ciclo de vida com fases bem distintas, aspectos bem documentados do desenvolvimento e padrões comportamentais além da alta similaridade com mamíferos e abelhas. O desenvolvimento deste projeto justifica-se pela necessidade de compreender quais possíveis alterações comportamentais o Roundup® pode causar em D. melanogaster, pois existem poucos estudos que buscam compreender tais efeitos e, mesmo sem demonstrar significativas alterações na mortalidade, o Roundup pode impactar o comportamento de diversas espécies. Ademais, tornar as análises comportamentais mais precisas com a utilização de técnicas computacionais mais modernas, gera resultados mais fidedignos e segue o princípio dos três Rs, sugerido pelas comissões de ética e uso de animais na experimentação.

Animais
As moscas da espécie D. melanogaster adquiridas por doação do Laboratório de Evolução e Genética de Insetos (LEGIN) da Universidade Federal de Pelotas - UFPel serão mantidas em uma incubadora com fotoperíodo no Laboratório de Fisiologia Animal do Instituto de Biologia da UFPel, com temperatura mantida em 25ºC, ciclo claro/escuro de 12h e em meio de cultura convencional a base de farinha de milho conforme descrito por Aguiar et al. (2016).

Protocolo experimental
Moscas macho e fêmea de até 4h após a emersão serão expostas ao herbicida através do meio de cultura por 96h. No artigo publicado por Aguiar et al. (2016), do qual a proponente é coautora, doses de 1g/L a 5g/L não causaram mortalidade significativa após exposição por 96h. Como essas doses são consideradas muito elevadas e podem impactar a ingestão de alimento, neste projeto, serão utilizadas as doses de 1mg/L, 2mg/L e 5mg/L. Essas doses tem como referência a concentração de glifosato na mistura comercial do herbicida.
O herbicida será adicionado durante a preparação do meio de cultura próprio para exposição. Este meio de cultura é composto de água, levedura, açúcar, leite em pó, ágar e nipagin (FIGUEIRA et al., 2017). 5mL de meio de cultura contendo as diferentes doses de Roundup® ou água para o grupo controle serão adicionados em frascos de vidro de 100mL. Serão colocadas 5 moscas por frasco. Assim, o experimento terá os seguintes grupos experimentais: grupo controle, 1mg/L, 2mg/L e 5mg/L de Roundup® para o sexo masculino; e os mesmo grupos experimentais para o sexo feminino.
As análises comportamentais serão realizadas 96h após o início da exposição ao Roundup®. O experimento será repetido, pelo menos, 3 vezes.

Teste do campo aberto
Para as análises comportamentais, será criado um ambiente de experimentação comportamental. Este ambiente consistirá em uma caixa branca de 60cm de largura, 60cm de comprimento e 70cm de altura. A caixa terá uma porta para que possa ser acomodado no seu interior o aparato para realização do teste do campo aberto, que será descrito logo abaixo. A iluminação do ambiente de experimentação será feita por fita de LED aplicada em toda a borda superior interna da caixa. Esses cuidados se devem ao fato de as moscas se orientarem pela iluminação, evitando, assim, interferências externas. Além disso, a temperatura na sala onde o ambiente de experimentação estará alocado será mantida em 25ºC. O aparato para realização do teste do campo aberto é uma arena circular transparente, com 6cm de diâmetro, como uma placa de Petri, porém, com apenas 2mm de altura para evitar que as moscas se desloquem verticalmente.
Após 96h do início da exposição ao Roundup®, as moscas serão anestesiadas no gelo e colocadas individualmente no aparato (n = 15). Imediatamente após a mosca ser colocada na arena, a mesma será acomodada no centro do ambiente de experimentação que terá a porta fechada e será iniciada a gravação de 10min. A gravação será realizada com uma câmera conectada a um computador.
A câmera deve ser capaz de produzir uma imagem clara das patas e das asas do animal. Para isso, a gravação deverá ser feita em alta resolução e exibindo, pelo menos, 30 quadros por segundo. Esse tipo de vídeo pode ser capturado pela câmera Bioptika Digital CMOS HD 1080P. O computador ao qual a câmera ficará acoplada deverá ter capacidade para processar e analisar os vídeos. Com tamanha qualidade de imagem, faz-se necessário que o computador seja próprio para as análises. O programa Virtual Dub 1.10.4.0 será utilizado para gravação dos vídeos.
As análises comportamentais serão realizadas durante 10min utilizando o software Etho Watcher (CRISPIM JUNIOR et al., 2012). Neste software é possível criar um catálogo comportamental a partir de um vídeo teste indicando quais os comportamentos podem ser esperados. Esse catálogo é utilizado para as análises posteriores. Serão quantificados o tempo para recuperação da anestesia, o tempo de caminhada para avaliar a locomoção, o tempo de imobilidade, o número e o tempo de duração dos episódios de grooming com as patas dianteiras, grooming com as patas traseiras e grooming das asas. A diferenciação do grooming com as patas dianteiras, traseiras ou das asas se deve ao fato de que diferentes grupos de neurônios são responsáveis por cada tipo de comportamento. Em abelhas, a redução da expressão do gene que codifica o receptor de dopamina tipo 1, ortólogo de D. melanogaster, aumentou os episódios de grooming com as patas dianteiras, porém, não com as patas traseiras (MUSTARD et al., 2010). No estudo realizado pela proponente Figueira et al. (2017b) o herbicida atrazina causou aumento do número de episódios de grooming associado ao aumento na expressão gênica da enzima de síntese de dopamina e todos os receptores para dopamina em D. melanogaster.
As análises comportamentais serão realizadas com 15 moscas para cada um dos grupos experimentais advindas de 3 repetições independentes do protocolo experimental.
Conforme a Lei Federal nº11.794/08, artigo 2º, as Comissões de Ética no Uso de Animais estão ligadas à avaliação das atividades de ensino e pesquisa que envolvem animais das espécies classificadas como filo Chordata, subfilo Vertebrata (BRASIL, 2008). Assim, para a execução desta proposta, não se faz necessária a aprovação da Comissão de Ética.

Expressão gênica por PCR-RT
A fim de compreender melhor a relação entre alterações comportamentais e os efeitos do Roundup® na neurotransmissão dopaminérgica, serão determinamos os níveis de expressão gênica de mRNA para o sistema dopaminérgico. Após a exposição ao Roundup® por 96h, 12 moscas serão anestesiadas no gelo e o RNA total extraído com o reagente Trizol (Invitrogen) seguinto o protocolo do fabricante. A integridade do RNA será verificada por análise de eletroforese em gel (1% de agarose) e a quantificação subsequente realizada espectrofotometricamente (260 e 280 nm). A concentração de RNA será padronizada para posterior confecção de cDNA empregando o Kit de Transcrição High Capacity Reverse (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante. As sequências de cDNA serão amplificadas por análise de PCR- RT utilizando o Kit GoTaq® Probe qPCR (Promega). Serão analisados os genes que codificam as enzimas da via de síntese de dopamina: tirosina hidroxilase (ple) e DOPA descarboxilase (ddc). Também serão analisados os genes que codificam proteínas responsáveis pela interrupção da neurotransmissão dopaminérgica, como a enzima que desativa a dopamina a dopamina N acetiltransferase (aanat1) e o transportador de dopamina (dat). E, por fim, serão analisados os genes que codificam os receptores para dopamina: receptor 1 tipo D1 (dop1r1), receptor 2 tipo D1 (dop1r2 ou damb), receptor DA/ecdisteróide (dopecr) e receptor tipo D2 (dop2r). Os genes tubulina (βtub56d) e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (gpdh) serão utilizados para normalizar a expressão gênica. A expressão gênica será calculada através da quantificação relativa do gene dividida pelo fator de normalização calculado e expressa em relação ao grupo controle.

Análise estatística
Será realizado o teste de Shapiro-Wilk para analisar a normalidade dos dados e o teste de Bartlett para a homogeneidade das variâncias. Dados não paramétricos serão transformados. Após, os dados serão analisados pelos testes one-way ANOVA, seguido de Newman-Keuls quando apropriado.

a) Avaliar o impacto da exposição ao Roundup® na capacidade de locomoção de D. melanogaster;
b) Identificar possíveis alterações no comportamento de limpeza (grooming) de D. melanogaster após exposição ao Roundup®;
c) Investigar possíveis relações do sistema dopaminérgico com neurotoxicidade do herbicida Roundup®.
A análise comportamental é uma importante via de descobertas para mecanismos neurotóxicos. Assim, com esses objetivos, espera-se identificar se, mesmo sem causar alterações na mortalidade, significativas alterações comportamentais podem ser encontradas nas moscas expostas ao Roundup® quando comparadas às moscas do grupo controle. Além disso, espera-se encontrar quais os possíveis alvos da neurotoxicidade do Roundup® no sistema dopaminérgico.
O grooming é um comportamento normal realizado pelo animais. Porém, quando realizado em excesso, pode representar uma mania característica do comportamento tipo ansioso (SMOLINSKY et al., 2009). Já a atividade locomotora e exploratória pode ser utilizada como um indicativo do comportamento tipo depressivo (ARAUJO et al., 2018). Assim, o teste do campo aberto representa uma importante ferramenta para investigar desordens do sistema nervoso. Além disso, alterações na atividade locomotora podem representar uma fisiologia do sistema locomotor alterada.
Em D. melanogaster poucos estudos dedicam-se a mostrar alterações comportamentais causadas pelo Roundup®. No estudo de Bednářová et al. (2020), já citado na introdução desta proposta, o Roundup® impactou a locomoção das moscas expostas, reduzindo a escalada dos animais. Esse resultado é semelhante ao encontrado em mamíferos, zebrafish e ao voo mais lento das abelhas (AITBALI et al., 2018; BALBUENA et al., 2015; FORNER-PIQUER et al., 2021).
As doses utilizadas por Aguiar et al. (2016) demonstraram que o Roundup® causa alterações redox, como aumento da geração de EROS e ativação de vias de defesa
antioxidante. O tecido nervoso é bastante sensível as alterações redox (VAN DER PLASSE et al., 2015) e as EROS tem sido relacionadas a diferentes tipos de alterações comportamentais associadas a doenças neurodegenerativas (JOHRI E BEAL, 2012). Além disso, os resultados encontrados a partir desta proposta associados ao amplo mapeamento do sistema nervoso da D. melanogaster, com sistema de neurotransmissão já bem descritos, pode fornecer uma importante indicação dos alvos do glifosato no sistema nervoso. Por isso, serão realizadas as análises para avaliar a expressão de genes relacionados ao sistema dopaminérgico implicado em uma ampla variedade de alterações comportamentais como o comportamento tipo de depressivo e ansioso.
Como o Roundup® é uma mistura de diversas substâncias, alguns pesquisadores testam separadamente a toxicidade dos seus compostos. O surfactante POEA foi recentemente reportado como sendo a substância que reduz mais significativamente a expectativa de vida e a fertilidade de D. melanogaster (BEDNÁŘOVÁ et al., 2020). Assim, com a aquisição dos equipamento necessários para a exposição dos animais, montagem de um ambiente de experimentação e análises comportamentais, uma das perspectivas futuras, após a execução desta proposta, é identificar as possíveis alterações comportamentais causadas pelo glifosato e o surfactante separadamente. Além disso, os equipamentos serão úteis para análises comportamentais em outros trabalhos com D. melanogaster, avaliando os efeitos de outros herbicidas a base de glifosato, o surfactante e outros agrotóxicos.