Portal InstitucionalUFPEL

A leptospirose é uma doença infecciosa causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira (FAINE et al.,1999). Estima-se que a doença acomete anualmente cerca de 1,03 milhões de pessoas, com mais de 58.900 mortes (COSTA et al., 2015). A leptospirose é considerada a doença zoonótica mais difundida no mundo, atribuída principalmente à grande diversidade de hospedeiros mamíferos que eliminam a bactéria causadora em sua urina (KO et al. 2009). Os humanos são infectados com essa bactéria por meio do contato com ambientes contaminados e exibem uma ampla gama de manifestações clínicas, desde uma doença febril leve, até insuficiência renal e hepática, problemas pulmonares e insuficiência reprodutiva (HAAKE E LEVETT, 2015). Em saúde animal, a leptospirose está associada a problemas reprodutivos, como abortos e natimortos, recém-nascidos fracos e diminuição na taxa de crescimento, bem como na produção de leite. Assim, a leptospirose é um grande problema de saúde pública, além de causar altas perdas econômicas ao setor agrícola (ROCHA et al., 2017).
Atualmente, os métodos sorológicos utilizados na rotina para diagnóstico da leptospirose são testes de Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para detecção de anticorpos do tipo IgM, e Soroaglutinação Microscópica (MAT- Microscopic Agglutination Test). Por sua parte, os kits ELISA-IgM utilizados no diagnóstico são importados e de alto custo, e já a MAT, que utiliza cepas de leptospiras vivas para a reação com soros de humanos, apresenta desvantagens como a baixa sensibilidade na fase aguda da doença, elevado grau de reações cruzadas com outros sorovares e a necessidade de manter uma bateria de leptospiras vivas de diferentes sorovares. Além disso, o teste é demorado e trabalhoso para ser executado e requer a verificação periódica de cada sorovar em cultura. Portanto, a MAT é considerada perigosa para os trabalhadores de laboratório (HARTLEBEN et al., 2013). Por conseguinte, é necessário pesquisar novos métodos de diagnóstico mais promissores para esta enfermidade em humanos e animais.
As proteínas Erp-like e LemA estão presentes em diferentes espécies patogênicas de Leptospira spp. e são expressas durante a infecção in vivo estimulando a produção de anticorpos (ESHGHI et al., 2009; HARTWIG et al., 2011), que é uma característica importante para uso em diagnóstico sorológico. Em 2009, ESHGHI et al. relatam a lipoproteína ErpY-like, como um novo fator de virulência potencial de L. interrogans. A regulação positiva da expressão da proteína durante a infecção in vivo sugere que a proteína ErpY-like desempenha um papel importante no processo de infecção e, portanto, poderia servir como um fator de diagnóstico e um antígeno vacinal. Enquanto, a lipoproteína LemA de L. interrogans é um antígeno promissor envolvido no desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a leptospirose (HARTWIG et al., 2011), cuja função biológica e o possível papel na patogênese da Leptospira ainda não foram elucidados. Nosso grupo já demostrou o potencial de ErpY-like e LemA como vacinas (OLIVEIRA et al. 2018), e mais recentemente a proteína ErpY-like foi avaliada no diagnóstico da leptospirose suína, com resultados promissores (PADILHA et al., 2019). Portanto, com o desenvolvimento deste projeto pretende-se avançar nas pesquisas com Erp-like e LemA realizando a identificação in silico de epítopos antigênicos das proteínas de Leptospira spp. para construção de quimera recombinante e sua avaliação no desenvolvimento de um teste de diagnóstico sorológico imunoenzimático para controle da leptospirose humana e animal.

Análises in silico
As proteínas ErpY-like (LIC11966) e LemA (LIC11058) de Leptospira spp. serão analisadas através de determinados preditores disponíveis online. O uso de tais ferramentas auxiliará na escolha dos melhores epítopos destas proteínas para uso em diagnóstico sorológico. O preditor Immune Epitope Database and Analysis Resource (www.iedb.org), será utilizado para a caracterização de epítopos de linfócitos B e T de humanos. A presença de epítopos de MHCII e de epítopos lineares de células B nos fragmentos expostos na membrana externa será predita utilizando os softwares ProPedII (http://www.imtech.res.in/raghava/propred/) e BepiPred-2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/), respectivamente. A ferramenta Basic Local Alignment Search Tool (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) será aplicada para o descobrimento de regiões contendo similaridades entre as sequências das proteínas alvo.
Produção das proteínas recombinantes
A sequência dos epítopos identificados para construção da quimera será enviada para a empresa GenOne (Rio de Janeiro, Brasil) para a síntese química e o gene entregue clonado no vetor de expressão de proteínas pAE. O plasmídeo contendo o gene recombinante será transformado em Escherichia coli BL21 (DE3). Após os ensaios de triagem de clones recombinantes, eles serão cultivados em 500 ml de caldo LB, até atingir a DO600 0,5 - 0,7 a 37 ºC, sendo então induzida a expressão com 1 mM de isopropil-β-1-D-tiogalactopiranosideo (IPTG). As células serão coletadas por centrifugação (7000 x g, 4 °C, 15 min), suspensas em um tampão de solubilização (8 M de uréia, 200 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl and 5 mM de imidazole, pH 8.0) e incubadas em shaker orbital a 60 rpm por 18 h, em temperatura ambiente. A purificação será realizada por cromatografia de afinidade utilizando colunas HisTrap de sefarose carregadas com níquel. A proteína purificada será dialisada contra tampão salina fosfato (PBS) 1X em 16 etapas durante 5 dias a 4 ºC e, após a concentração será determinada através do kit BCA Protein Assay (Pierce, USA) e armazenadas a -20 ºC.
Obtenção de soros humanos e de animais
Amostras de soros humanos e animais serão cedidas por laboratórios referência e credenciados para diagnóstico de leptospirose humana e animal, coletadas nos últimos 5 anos em diferentes regiões do Brasil. As amostras de humanos serão cedidas pelo Laboratório de Zoonoses Bacterianas, Centro de Referência Nacional para Leptospirose, Coleção de Leptospira (IOC/Fiocruz, Rio de Janeiro/RJ). Já as amostras de soros animais serão cedidas pelo Laboratório de Leptospirose, Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor (IPVDF, Eldorado do Sul – RS). Serão utilizadas no presente projeto, duzentas amostras de soros positivas e duzentas amostras negativas (caracterizadas na MAT quanto ao título de anticorpos e sorovar reativo) para cada espécie (humana, bovina, suína, ovina e equina).
Reconhecimento das proteínas pelo soro de humano e animais naturalmente infectados
A proteína quimérica recombinante purificada e dialisada será submetida a um Western blotting (WB) com soro de humanos e animais naturalmente infectados, caracterizados na MAT, e reagentes para diferentes sorovares, de forma a avaliar se a proteína é um bom alvo para reconhecimento de anticorpos gerados contra os mais diferentes sorovares de Leptospira spp. Para realização do ensaio de WB a proteína purificada será submetidas a um SDS-PAGE 15% e eletrotransferida para uma membrana de nitroceluse HybondTM ECLTM (Amersham Biosciences). A membrana será bloqueada com PBS acrescido de 0,5% de Tween 20 e 5% de leite em pó desnatado, a 4° C, overnight e, após este período, lavada 3 vezes com PBS-T e incubada com os soros humanos reativos na MAT para a diferente sorovares, a temperatura ambiente por 1 hora. A membrana será então lavada 3 vezes com PBS-T e incubadas com o anticorpo secundário anti-IgM e anti-IgG espécie específico conjugado com peroxidase. As bandas serão reveladas com cromógeno. A proteína será também testada contra soros humanos negativos para leptospirose, nas mesmas condições descritas acima.
Avaliação do potencial da quimera recombinante no desenvolvimento de diagnóstico sorológico imunoenzimático para leptospirose
Teste diagnóstico no formato ELISA indireto será padronizado utilizando-se soros de humanos e animais positivos e negativos (caracterizados préviamente por MAT). Para o ELISA indireto, microplacas de poliestireno de 96 poços serão sensibilizadas com a quimera produzida, contendo 25 ng, 50 ng, 100 ng e 200 ng da proteína por cavidade. Após, o bloqueio dos poços será feito com PBS contendo Twen 20% (PBS-T) acrescido de 1% de Soro Fetal Bovino (SFB). Os soros positivos e negativos, bem como os conjugados espécie-específico, serão diluídos em PBS-T acrescido de 1% de SFB. As concentrações para os reagentes utilizados nas várias etapas dos procedimentos do ELISA (isto é, soros dos animais positivos e negativos, conjugado espécie-específico, soros controles) serão estabelecidas variando a concentração do reagente adicionado durante um passo particular enquanto se mantém as condições para todas as outras etapas em uma constante. Para a reação colorimétrica uma solução contendo (0.4 mg/mL o-phenylenediamine e 0.03% de H2O2 em 0.1 M tampão citrato, pH 4.0) será adicionado a placa.
Análise estatística
Para avaliar a especificidade, sensibilidade, acurácia, ponto de corte e valores preditivos do teste ELISA indireto, os resultados obtidos serão submetidos à análise ROC (Receiver Operating Characteristic) utilizando o software MedCalc estatística (versão 10.3.0), comparando seus resultados com o teste padrão, MAT.

Produtos esperados como resultado da execução do projeto
Espera-se obter uma quimera recombinante capaz de reagir com anticorpos presentes no soro de humanos e animais naturalmente infectados. Como serão utilizados soros caracterizados na MAT, com confirmação do sorovar infectante, vamos testar a quimera quanto a reatividade com a maior variedade de sorovares possível, indicando seu potencial uso em ensaio de diagnóstico sorológico capaz de detectar uma ampla diversidade de sorovares que infectam humanos e diferentes espécies animais. Assim, teremos um insumo biotecnológico de alto valor agregado. Espera-se realizar a padronização dos ensaios sorológicos imunoenzimáticos do tipo ELISA indireto, utilizando a proteína quimérica contendo epítopos antigênicos das proteínas ErpY-like e LemA. Isto é, determinar a diluição dos soros dos animais positivos e negativos, diluição do conjugado anti-IgM e anti-IgG espécie-específico, soros controles, condições de incubação, bloqueio e lavagens). Alem disso, espera-se realizar os ensaios de avaliação dos soros de humanos e animais com o intuito de avaliar a especificidade, sensibilidade, acurácia, ponto de corte e valores preditivos do teste ELISA indireto. Ao final deste projeto pretende-se obter ensaios do tipo ELISA indireto IgM e IgG para as diferentes espécies alvo, para uso em diagnóstico ou triagem de soros positivos para leptospirose.

Potencial de impacto dos resultados do ponto de vista técnico-científico, de inovação, difusão, sócio-econômico e ambiental
O uso de ferramentas de bioinformática e biotecnologia são aplicações de ponta nas pesquisas que visam desenvolvimento de insumos para controle de doenças infecciosas, a citar a leptospirose, uma zoonose negligenciada. Os pesquisadores envolvidos neste projeto têm trabalhado direta ou indiretamente nesta área. Os estudos desenvolvidos por eles têm gerado publicações científicas em periódicos de importância e também patentes. Portanto, esta pesquisa tem grande probabilidade de gerar insumos de alto valor agregado. Atualmente não existe um teste de diagnóstico sorológico do tipo ELISA para leptospirose utilizando proteínas recombinantes com tecnologia nacional, que possa substituir ou auxiliar a MAT, padrão ouro no diagnóstico desta doença, mas que apresenta uma série de inconvenientes. Com esse projeto, buscamos desenvolver um teste de diagnóstico sorológico do tipo ELISA indireto, que seja mais eficaz e menos oneroso, pela utilização de antígenos proteicos conservados (ErpY-like e LemA) e de uma estratégia inovadora, que utiliza a análise in silico na busca de epítopos antigênicos nestas proteínas, e construção de uma quimera, visando melhorar seu desempenho em diagnóstico/triagem sorológica. Assim, esperamos chegar a um teste de diagnóstico para humanos semelhante ao utilizado atualmente (ELISA-IgM) pelos LACENs, mas que seja desenvolvido e produzido aqui em nosso país, podendo, portanto, substituí-lo, visto que é importado e de alto custo. Já para animais, o ensaio ELISA produzido a partir deste projeto, poderia ser utilizado em rebanhos para triagem de animais com leptospirose, permitindo a análise de um maior número de amostras de soro de uma forma mais rápida e fácil, em comparação com a MAT. Essa triagem nos rebanhos facilitaria a escolha do tipo de manejo a ser adotado, visando diminuir a contaminação ambiental e disseminação da doença dentro dos rebanhos, reduzindo as perdas econômicas neste setor que são acarretadas pela doença. Isto evitaria ainda que animais domésticos, silvestres e também o homem fossem infectados, com redução no número de casos. Além de gerar produtos, que devem ser protegidos através da solicitação de patentes e possivelmente transferência de tecnologia, este projeto resultará em publicações científicas em periódicos especializados internacionais. Também, possibilitará a divulgação dos dados em congressos científicos, treinamento de estudantes de graduação e pós-graduação e consolidação da área de pesquisa junto à UFPel.