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A leptospirose permanece como uma doença reemergente e negligenciada, considerada um problema tanto do ponto de vista de saúde púbica como econômico, causando perdas severas na produção animal. A grande variação antigênica entre os mais de 300 sorovares capazes de infectar humanos e animais resulta na carência de vacinas comerciais capazes de conferir amplo espectro de proteção contra a doença. Logo o uso estratégico da bioinformática associada a ferramentas biotecnológicas aplicadas na identificação e design de antígenos imunogênicos são indispensáveis para o desenvolvimento de vacinas de nova geração que possam superar as limitações encontradas nas vacinas convencionais.

-Imunização de hamsters sírios:
Em todos os experimentos os animais receberão duas doses de 0,1 ml de cada formulação vacinal administradas por via intramulscular com um intervalo de 14 dias, utilizando Hidróxido de Alumínio como adjuvante. Amostras de sangue serão coletadas nos dias 0 (pré-vacinação), 14 e 28 pós-vacinação. O soro será separado por centrifugação e armazenado à -20 °C até a sua utilização. Após a última coleta de sangue (dia 28 pós-primeira dose) os animais serão desafiados com diferentes doses de um inóculo letal das cepas: L. interrogans serovar Copenhageni cepa L1-130 e L. interrogans sorovar Canicola cepa LO-4. Os animais infectados serão monitorados diariamente durante 28 dias. Animais com sinais clínicos de leptospirose e moribundos serão eutanasiados conforme normas e regulamentos do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA. A eficácia da vacina será determinada pelo número de animais sobreviventes ao desafio, quando comparado ao grupo controle. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados de acordo com as normas internacionais e em consonância com os princípios éticos de experimentação animal do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA. Após necropsia para coleta de amostras biológicas os animais eutanasiados serão congelados e entregues ao Biotério Central da UFPel, que os encaminha para incineração.

-Avaliação da resposta imune induzida em hamsters:
A resposta imune humoral será avaliada por ELISA utilizando cada proteína recombinante de Leptospira que compõe a vacina analisada. Para determinação de IgG total, cada proteína recombinante será confrontada com os soros dos animais imunizados. Anti-IgG de Golden Syrian hamsters conjugado com peroxidase (Rockland) será utilizado como anticorpo secundário. A avaliação do perfil de subclasses induzidas será realizada com anticorpos anti-IgG3 e anti-IgG2/3 (SouthernBiotech) conforme recomendações do fabricante.

Após a eutanásia tecidos renais, pulmonares e hepáticos serão coletados para histopatologia, imprint, cultura em meio EMJH e PCR. A indução de imunidade esterilizante será avaliada com base no isolamento de leptospiras através de cultura dos rins, na identificação de patologia associada à doença nos animais sobreviventes e a quantificação da carga de leptospiras através de PCR em tempo real.

-Análise estatística:
Os testes de Fisher e Wilcoxon log-rank serão utilizados para determinar diferenças significativas nas taxas de mortalidade e sobrevivência dos grupos, respectivamente. Análise de variância (ANOVA) será utilizado para determinar diferenças significativas nos ensaios sorológicos. Diferenças serão consideradas significantes com um valor de P < 0,05. Todas as análises serão conduzidas no software GraphPad Prism 8 (GraphPad Software).

Os resultados que serão obtidos poderão gerar inovação tecnológica (uma nova vacina contra leptospirose), da qual será requerida a proteção da propriedade intelectual através do depósito de patentes. Além disso, a execução do projeto possibilitará a formação de recursos humanos e a geração de conhecimento que será divulgado através de artigos científicos e de outros meios de divulgação científica.