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O agronegócio corresponde em média a 20% do PIB nacional nos últimos 5 anos, com o setor agrícola correspondendo a 68% desse percentual (R$1,06 trilhão). A soja é a principal commoditie nacional, arrecandando em média R$165,49 bilhões nos últimos dois anos. Nos últimos 20 anos foi a cultura com maior incremento de produção e área cultivada no país. São em média 103 milhões de toneladas produzidas e expansão de 1.244.000 hectares anuais nos últimos 10 anos. Para 2020/21 estima-se produção de 134 milhões de toneladas, em área equivalente a 38,6 milhões de hectares. Neste cenário, o Rio Grande do Sul (RS), em condições normais, briga pela segunda colocação no ranking de produção nacional, representando em média 16,7% do total produzido. Entretanto, na safra 2019/2020 o Estado ficou na quarta colocação devido à quebra ocasionada pelo déficit hídrico.
A manutenção da produtividade da soja depende do manejo de fatores de origem abiótica e biótica. Dentre os bióticos, a incidência de plantas daninhas é indesejada pela competição por recursos limitantes como água, luz e nutrientes.
Dentre as espécies que infestam a cultura da soja, destaca-se Amaranthus retroflexus, a qual é uma Amaranthaceae anual, de ciclo fotossintético C4, prolífica, com sementes de alta longevidade e germinação escalonada. Possui rápido crescimento inicial, ampla variabilidade genética e adaptação a condições adversas. Suas características a tornam uma das principais Amaranthaceaes daninhas no mundo, competindo por recursos com culturas como soja (Glycine max), feijão (Phaseolus spp.) e milho.
Dessa forma, para geração de informações consistentes para o manejo de plantas daninhas, a identificação correta das espécies de Amaranthus é necessária, bem como conhecer as taxas de hibridização e de transferência de resistência entre as espécies. De forma similar a caracterização da resistência aos inibidores da ALS e EPSPS é importante, considerando que estes estão entre os quatro mecanismos de ação mais utilizados no manejo de plantas daninhas no mundo. Assim como, compreender o tempo e os aspectos que promovem a resistência ao fomesafen é necessário para desenvolver ações acertadas na prevenção da resistência a este herbicida. Como foco final, a compreensão da dinâmica do banco de sementes da espécie é importante para saber o momento de aplicação que proporcionará maior eficácia de controle.

O projeto prevê a realização de cinco estudos, desenvolvidos em casa de vegetação e laboratório pertencentes ao Centro de Estudos em Herbologia (CEHERB), da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) no período de março de 2020 a março de 2024.
Serão coletadas sementes de caruru de lavouras de soja RR em municípios do Estado do Rio Grande do Sul. O material será coletado em locais onde relatou-se dificuldades de controle e passarão por um screening para avaliação da sensibilidade dos biótipos. Posterior a isso, dois biótipos serão selecionados para dar seguimento aos estudos. Os critérios para a seleção dos biótipos serão: a sobrevivência de um deles à máxima dose de registro aplicada dos herbicidas chlorimuron (100 g i.a. ha-1) e glyphosate (1440 g e.a. ha-1); que ambos biótipos (suscetível e resistente) procedam do mesmo local; e, que o biótipo suscetível também apresente alta sensibilidade ao herbicida fomesafem para os estudos de epigenética.
Para alcançar os objetivos do projeto, serão realizados estudos distribuídos em cinco capítulos, conforme segue:

CAPÍTULO I: MARCADORES MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE CARURU, HIBRIDIZAÇÃO ENTRE Amaranthus spp. E HERANÇA DA RESISTÊNCIA ENTRE HÍBRIDOS

Este capítulo será composto por três estudos, no primeiro deles serão utilizados marcadores moleculares para confirmar se as espécies estudadas tratam-se de A. retroflexus, o segundo estudo prevê a quantificação da taxa de hibridização entre as espécies de Amaranthus e a comparação morfológica e ecofisiológica dos filhos em relação aos pais e; o terceiro estudo será um screening para avaliar a transmissão da resistência para os híbridos.

- ESTUDO I: Marcadores moleculares na identificação Amaranthus spp.
- ESTUDO II: Taxa de hibridização, caracterização morfológica e ecofisiológica de híbridos de Amaranthus e transferência da resistência aos inibidores da ALS e EPSPS

CAPÍTULO II: CARACTERIZAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE A. retroflexus AOS HERBICIDAS INIBIDORES DA ALS

Para este capítulo será inicialmente feito um estudo de curva dose-resposta para confirmar a resistência cruzada aos herbicidas chlorimuron e imazethapyr. Confirmada a resistência para um dos biótipos, serão feitos estudos para descobrir o mecanismo envolvido na resistência do biótipo.

- ESTUDO III: Curva dose-resposta e confirmação da resistência ao chlorimuron e imazethapyr
-ESTUDO IV: Sequenciamento da enzima ALS para detecção de mutações que conferem resistência
- ESTUDO V: Metabolismo de chlorimuron e imazethapyr em biótipos de A. retroflexus suscetível e resistente aos inibidores da ALS

CAPÍTULO III: CARACTERIZAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE A. retroflexus AOS HERBICIDAS INIBIDORES DA EPSPS

Para este capítulo será inicialmente feito um estudo de curva dose-resposta para confirmar a resistência ao glyphosate. Confirmada a resistência para um dos biótipos, serão feitos estudos para descobrir o mecanismo envolvido na resistência do biótipo, baseados nos principais mecanismos encontrados na literatura para o gênero Amaranthus.

- ESTUDO VI: Curva dose-resposta e confirmação da resistência ao glyphosate
- ESTUDO VII: Sequenciamento da enzima EPSPS para detecção de mutações que conferem resistência
- ESTUDO VIII: Número de cópias da EPSPS e expressão gênica
- ESTUDO IX: Atividade enzimática da EPSPS e acúmulo de shiquimato
- ESTUDO X: Atividade antioxidante em biótipos de A. retroflexus suscetível e resistente ao glyphosate
- ESTUDO XI: RNAseq na análise do mecanismo de resistência aos inibidores da EPSPS

CAPITULO IV: FATORES EPIGENÉTICOS ENVOLVIDOS NA EVOLUÇÃO DA RESISTÊNCIA DE A. retroflexus AOS HERBCIDAS INIBIDORES DA PROTOPORFIRINOGÊNIO OXIDASE (PPO)

Para avaliar a participação da epigenética na evolução da resistência de A. retroflexus aos inibidores da PPO, serão realizados experimentos em casa de vegetação e laboratório. Para tal, um biótipo de caruru previamente testado quanto a sua sensibilidade ao herbicida fomesafen e a outros herbicidas que matam a planta por estresse oxidativo será selecionado para dar seguimento aos estudos.
Para realização dos estudos, inicialmente será realizada uma curva dose-resposta ao fomesafen, utilizando apenas doses igual ou inferiores à dose de registro, a fim de avaliar a dose máxima que poderá ser utilizada ao longo das gerações. As doses utilizadas serão: 2,6; 5,2; 10,4; 20,8; 41,6; 83,3; 166,6; e 250 g i.a. ha-1 e a metodologia para aplicação está previamente descrita no item 7.2.1. A dose selecionada será a máxima dose aplicada que permitiu o restabelecimento da planta em até 30 DAA. Complementar a isso, haverá um segundo tratamento com metade da dose selecionada.
Em posse do grau de sensibilidade inicial do biótipo ao fomesafen, serão feitas aplicações das duas doses ao longo de no mínimo seis gerações. Em cada geração, dez plantas serão transplantadas para vasos de 8 L, contendo solo, para produção de sementes para a geração seguinte. Além disso, ao longo de cada geração serão feitos estudos para avaliar a evolução dos níveis de metilação global e específica do DNA e atividade das enzimas envolvidas na metabolização de herbicidas e de mecanismos antioxidantes. A cada geração, será feito ainda um estudo de curva dose-resposta, para avaliar a evolução da sensibilidade ao herbicida. Em caso de se conseguir chegar em uma geração resistente, serão feitos estudos complementares de RNAseq entre as gerações inicial e final para elucidação do mecanismo de resistência e de metabolismo de fomesafen. Serão testados também outros herbicidas com mesmo mecanismo de ação ou ainda, que matem a planta por estresse oxidativo, para avaliar a ocorrência de resistência cruzada e múltipla.
Para o experimento de curva dose-resposta, as doses utilizadas serão 0; 5,2; 10,4; 20,8; 41,6; 83,3; 166,6; 250; 500; e 1.000 g i.a. ha-1.

CAPÍTULO V: DESENVOLVIMENTO E GERMINAÇÃO DE A. retroflexus SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE TEMPERATURA E FOTOPERÍODO
Para este experimento as mudas de A. retroflexus produzidas serão transplantadas para vasos de 8L para que não haja limitação por recursos ao longo do desenvolvimento das plantas. Para compreender os efeitos que a temperatura e o fotoperíodo tem na reprodução e nos níveis de dormência da espécie, serão conduzidos dois experimentos em delineamento inteiramente casualizado, em esquema bifatorial com seis repetições.
O experimento será focado em compreender o efeito da temperatura na viabilidade e dormência das sementes. Nesse caso, o fator A serão as diferentes épocas de desenvolvimento e o fator B os diferentes locais. Para submeter as plantas a condições extremas, serão realizadas seis épocas a cada ano (2021 e 2022). Quatro das épocas de semeadura ocorrerão na data de início de cada uma das estações do ano 21/03, 21/06, 21/09, 21/12, as outras duas serão realizas na época preferencial de emergência da espécie 21/10, 21/11. As plantas serão cultivadas em três locais: casa de vegetação fechadas, casa de vegetação aberta e em ambiente externo, para se ter diferentes regimes de temperatura. A temperatura será medida com auxílio de termo-higrômetro digital, instalado em cada um dos ambientes.
O experimento 2 visa compreender qual fator é mais importante para a determinação do nível de dormência da planta: temperatura ou fotoperíodo. Nesse caso, o fator A representará as diferentes épocas de desenvolvimento (mesmas do experimento 1) e o fator B o fotoperíodo. Ao longo de cada época as plantas serão expostas a três condições de fotoperíodo: condição natural, interrupção de luz e suplementação de luz. A interrupção de luz será realizada com auxílio de estrutura de madeira e tecido preto, que será colocada encima das plantas, fazendo com que a planta receba diariamente 8 h de luz. A suplementação de luz será realizada com lâmpadas de LED utilizadas em fitotron, de luz vermelha e azul, para que as plantas recebam 16 h de luz.
Em cada um dos experimentos serão feitas coletas de semente ao longo de três estádios da planta: início da produção de sementes, plena produção de sementes e maturidade fisiológica. Para cada uma dessas épocas serão realizados testes de germinação nos quais as sementes serão distribuídas em caixas gerbox, contendo papel mata-borrão previamente umedecido com água destilada em volume equivalente a 2,5 vezes o peso do papel. As sementes serão mantidas em BOD a 30 °C e fotoperíodo de 14 h, por 14 dias. Serão realizadas contagens de plântulas normais aos 7 e 14 DAT. As sementes que não germinarem serão submetidas a teste de tetrazolio para análise de viabilidade.
Para o teste de viabilidade, as sementes serão cortadas transversalmente a fim de expor o embrião. Após, serão colocadas em becker protegido com papel alumínio, contendo a solução de sal de tetrazolio a 1% por 16 horas a 25 °C. Serão consideradas sementes viáveis aquelas que apresentarem coloração rosa ou carmim (BRASIL, 2009).
Para a coleta realizada no estádio de maturação fisiológica da planta, também serão separadas 800 sementes de cada tratamento, preferencialmente de uma única planta para realização de estudo complementar. O estudo tentará avaliar fluxo de emergência das sementes ao longo dos seis primeiros meses após sua coleta em diferentes profundidades de solo. As sementes selecionadas de cada tratamento serão semeadas em caixas de leite com solo previamente esterilizado em autoclave em seis profundidades de enterrio (0; 0,25; 0,5; 1; 2; 4 e 8 cm). A contagem de fluxo de emergência será realizada a cada 15 dias e as plantas contabilizadas serão retiradas da unidade experimental. Para evitar infestação do solo com sementes de fora, será montada uma estrutura com lona plástica transparente.
Os resultados obtidos serão analisados quanto à normalidade (teste de Shapiro Wilk) e homocedasticidade (teste de Hartley). Em sequência será feita análise da variância (p≤0,05). Quando constatada significância estatística, os tratamentos serão comparados pelo teste de Duncan (p≤0,05).

Validar marcadores moleculares que identificam as espécies de caruru existentes no Brasil utilizando RT-PCR.
Comprovar a resistência múltipla de A. retroflexus aos inibidores da ALS e EPSPS, com os respectivos mecanismos promotores da resistência.
Determinar o metabolismo, níveis de metilação e expressão enzimática ao longo de seis gerações de A. retroflexus aplicadas com subdses de fomesafen para avaliar o papel da epigenética na evolução da resistência a este herbicida.
Comprovar que a memória da planta estimula maiores níveis de dormência quando submetidas a diferentes condições de fotoperíodo e temperatura.