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A esporotricose é uma zoonose grave e cosmopolita causada por fungos termodimórficos do gênero Sporothrix spp. (BERNARDES-ENGEMANN, 2017, CHAKRABARTI et al., 2015). Existem duas principais rotas de transmissão do Sporothrix spp. para humanos, uma rota sapronótica envolvendo o contato direto do homem com matéria orgânica ou solo contaminado e a rota zoonótica, a qual a infeção é transmitida pelos felinos (OROFINO-COSTA & RODRIGUES, 2017). A transmissão zoonótica é a mais frequente em humanos e é resultante da inoculação direta do fungo na forma leveduriforme por meio de arranhadura e/ou mordedura de gatos domésticos infectados, portanto, gato tem um papel importante na cadeia epidemiológica da transmissão da doença para humanos (MARQUES-MELO et al., 2014; NOBRE et al., 2002, KERSTING et al., 2014). (FREY et al., 2011; MONTENEGRO et al., 2015; LOPES-BEZERRA et al., 2018).
A apresentação clínica da esporotricose nos felinos domésticos é mais agressiva, com lesões disseminadas e comprometimento do estado geral dos animais, levando muitos deles ao óbito. As lesões podem se apresentar como múltiplos nódulos ulcerativos, drenando exsudato castanho avermelhado, formação de crostas, celulite e tecido necrótico. Geralmente estas lesões localizadas nas regiões de cabeça, orelhas, garras, membros e base da cauda, podendo a forma localizada tornar-se disseminada (ANTUNES et al., 2009a; LLORET et al., 2013; FORLANI et al., 2018).
Em humanos as principais formas clínicas da esporotricose são cutânea fixa, linfocutânea e cutânea disseminada, podendo ocorrer, mais raramente, as formas extracutâneas, acometendo ossos, articulações e pulmões (MADRID et al., 2007b; ANTUNES et al., 2009a). Em cães e equinos, as formas mais comuns da doença são a linfocutânea e a cutânea fixa, podendo haver a presença de nódulos, úlceras e crostas localizadas (ANTUNES et al., 2009a). No Rio de Janeiro a esporotricose felina é um problema urbano endêmico/epidêmico (BARROS et al.,2004; SCHUBACH et al, 2004; SILVA et al., 2012; ALMEIDA et al., 2018). Desde 1998, o estado do Rio de Janeiro sofre com a maior epidemia da esporotricose por transmissão zoonótica do mundo (MARTINS, 2006; PEREIRA et al., 2014; MACÊDO-SALES et al., 2018). O Estado do Rio Grande do Sul também apresenta relevante ocorrência de esporotricose zoonótica transmitida por felinos. A partir dos anos 2000 diversos relatos foram publicados, todos com relação zoonótica (NOBRE et al., 2001; NOBRE et al., 2000; XAVIER et al., 2004; MEINERZ et al., 2007b; KERSTING et al., 2014; BASTOS et al., 2017). Nos últimos anos começou-se a registrar casos de esporotricose felina em outros estados do Brasil, como Santa Catarina (COLODEL et al., 2009), Paraíba (NUNES et al., 2011), Minas Gerais (BARROS et al., 2012), São Paulo (BORGES, 2007) Distrito Federal (CORDEIRO et al., 2011), Alagoas (MARQUES-MELO et al., 2014) e Pernambuco SILVA et al., 2018), sendo também documentada a transmissão para humanos, em alguns desses casos. Esse aumento no número de diagnósticos está possivelmente relacionado ao crescimento de felinos domésticos como animais de companhia, assim como ao aumento da suspeita clínica de esporotricose e também a melhoria no diagnóstico laboratorial (SCHUBACH et al., 2004).
Apesar do impacto da espotricose na saúde humana e animal, não existe uma vacina disponível contra a infecção. Além disso, a disponibilidade de genomas de cepas de Sporothrix spp. anotados ainda é relativamente baixa, o que dificulta a aplicação de análises comparativas moleculares (Lopes-bezerra et al., 2018), limitando, deste forma, os estudos de Vacinologia Reversa para identificação de potenciais alvos vacinais. Outro fator limitante para análise de candidatos vacinais em grande escala é o fato de que os fungos são microrganismos eucariotos e proteínas glicosiladas como componentes chaves da parede celular de Sporothrix spp. (Lopes-bezerra et al., 2018).
Baseado no potencial descrito dos antígenos Gp70 e SsEno até o momento, o presente projeto objetiva utilizar ferramentas de imunoinformática para desenvolver uma proteína quimérica composta por multi-epítopos destes dois antígenos. Para a produção destas subunidades recombinantes tem-se utilizado sistemas de expressão em procariotos (HARTWIG et al., 2010;HARTWIG et al., 2011;SEIXAS et al., 2007b; SILVA et al., 2007). Dentre as vacinas recombinantes existentes, podemos destacar as vacinas de subunidade, que apresentam a clara vantagem de serem licenciadas pelos órgãos de regulamentação competentes (CLARK; CASSIDY-HANLEY, 2005) e de apresentarem pouco ou nenhum efeito colateral (KOIZUMI; WATANABE, 2005b). Neste presente projeto, diferentes formulações da proteína quimérica serão preparadas para avaliar a eficácia protetiva frente a desafio letal e o padrão de resposta imune humoral e celular induzida por essas formulações contra esporitrocose em modelo experimental murino. Além disso, da proteína quimérica produzida será utilizada no desenvolvimento de um diagnóstico indireto sensível e específico para a esporotricose felina e, utilizada vacina terapêutica em felinos naturalmente infectados.
O padrão ouro para o diagnóstico de esporotricose é o isolamento e a identificação das espécies de Sporothrix a partir de amostras clínicas. É um método de diagnóstico simples e de baixo custo, contudo o resultado é demorado e não é sensível para algumas formas sistêmicas e atípicas de esporotricose. Em animais sintomáticos, após a identificação das lesões, a confirmação da esporotricose também pode ser realizada por citologia, histopatologia, inoculação em modelos biológicos, reação intradérmica ou PCR (ANTUNES et al., 2009a; LARSSON, 2011). Teste sorológico ELISA usando o antígeno de parede celular da fase de levedura denominado SsCBF (Sporothix schenckii ComA-Binding Fraction) . Testes realizados em amostras de soro de pacientes com diferentes graus de esporotricose clínica resultaram em altas taxas de sensibilidade e especificidade, 90% e 80% respectivamente, além de alta reatividade em amostras de soros de amostras de soro de felinos infectados (Bernardes-Engemann AR, et al 2005; Fernandes GF, Lopes-Bezerra LM et al, 2011). Outros componentes importantes da parede celular no Sporothrix spp foram estudados como novos biomarcadores para o diagnóstico de esporotricose, as glicoproteínas de 60 kDa e 70 kDa. Tais proteínas parecem se comportar como um fator de virulência, eles são expressos nos isolados mais virulentos de Sporothrix, e contribuiem para a aderência do fungo e imunomodulação. (Fernandes GF et al.; 2013; Alba-Fierro CA et al, 2014; Alba-Fierro CA et al, 2016 48,90-93). Esses testes não estão disponíveis comercialmente, sendo restritos a determinados centros de pesquisa. Novos alvos e o desenvolvimento de novos testes de diagnóstico com tecnologia nacional são estratégicos para o controle da esporotricose no Brasil, especialmente, em regiões onde a infecção é considerada é endêmica ou hiperendêmica, dependendo da região do país.
Com base nisso, neste projeto estamos propondo desenvolver três abordagens distintas no controle da esporotricose: a) o desenvolvimento de uma vacina de subunidade para a profilaxia da infecção; b) produção e avaliação de uma vacina terapêutica em felinos naturalmente acometidos pela esporotricose e c) desenvolvimento de um ensaio diagnóstico sorológico para felinos. Para tanto buscaremos utilizar ferramentas de bioinformática para selecionar epítopos imunogênicos e antigênicos para produzir uma proteína recombinante expressa em sistema procarioto. Somado a todas estas abordagens descritas, estamos propondo ainda a avaliação de diferentes adjuvantes na vacina profilática utilizando camundongos como modelo. A proteína quimérica produzida será avaliada em felinos acometidos com a esporotricose em associação com o tratamento antifúngico recomendado para tratamento e por fim, os anticorpos da classe IgG presente os soros de felinos infectados serão avaliados no reconhecimento da proteína recombinante em ensaios de diagnóstico indireto. Com isso, almejamos ter como produtos finais ao presente projeto: uma nova vacina profilática contra a esporotricose; um incremento na terapêutica de animais acometidos e um diagnóstico rápido e de baixo custo para felinos. Com a execução do presente projeto as chances de obtenção de produtos inovadores e de grande impacto no controle da esporotricose no Brasil passam a ser reais.

SUBPROJETO 1 – Desenvolvimento de um ensaio de ELISA para a detecção sorológica e estadiamento da esporotricose felina.
As proteínas recombinantes SsEno e Gp70 foram selecionadas com base em minuciosa revisão bibliográfica de trabalhos científicos. Para a construção da quimera rchiSsEno-Gp70, serão utilizadas as sequências codificadoras (CDS) das proteínas SsEno e Gp70 depositadas no GenBank (ERS97971.1 e ERS98762.1, respectivamente) oriundas da cepa de Sporothrix schenckii ATCC 58251. As sequencias de aminoácidos destas proteínas serão analisadas pelas ferramentas e softwares de bioinformática. A proteína quimérica será expressa em sistema procarioto e utilizada como antígeno nos ensaios de diagnóstico sorológico.
ELISA Indireto
Serão utilizados soros de felinos provenientes do banco de soros do grupo ClinPet. Placas de microtitulação de poliestireno ELISA (Nunc Polysorp, Nalge Nunc International, Rochester, NY, EUA) serão sensibilizadas com a proteína quimerica rchiSsEno-Gp70 (100 ng/poço). As amostras se soro felino, comprovadamente positivos e negativos por meio do diagnóstico padrão ouro (cultura fúngica), serão diluídas 1: 100 em solução salina tamponada com fosfato Tween 20 e adicionadas à placa. Em seguida, será adicionado conjugado de peroxidase IgG anti-felino (Sigma-Aldrich, EUA) e a reação será revelada pela adição de uma solução contendo OPD e peróxido de hidrogênio. A reação colorimétrica será interrompida pela adição de 25 µL de 2 M H2SO4 por poço e a DO foi medida a 492 nm usando o leitor de ELISA VICTORTM X5 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer, EUA). O valor de corte será determinado como a DO média + dois desvios padrão do pool de soro felino (n = 47) diluído 1: 100 entre as amostras de soro desses animais, que foram negativas na cultura fúngica (Bomfim et al. 2005) . A avaliação do ELISA será realizada quanto à sensibilidade (capacidade do ELISA em identificar as amostras de soro positivas, que também foram positivas na cultura fúngica) e especificidade (capacidade do ELISA em identificar as amostras de soro negativas, que também foram negativas na cultura fúngica) (Mariya et al. 2006). Esses experimentos serão realizados em triplicatas. Serão utilizadas amostras de soro controle de felinos saudáveis (n = 20) e de felinos com outras doenças infeciosas, exceto esporotricose leptospirose (n = 30). Essas amostras foram compostas por soros de animais com sorologia positiva para o vírus da leucemia felina (Felv) (n = 20) e para o vírus da imunodeficiência felina (FIV) (n = 10). A concordância entre os ensaios de cultura fúngica e ELISA será determinada usando o teste usando o teste Chi-quadrado (χ2) (Statistics, versão 8.0).
Somente a partir da execução e análise dos resultados obtidos nestas etapas será procedido o estudo em modelo murino e posteriormente em felinos (espécie alvo), conforme descrito nos subprojetos 2 e 3.

SUBPROJETO 2 – Imunoinformática aplicada ao desenvolvimento de vacina recombinante para esporotricose felina
Esta etapa será realizada após execução e análise dos resultados do subprojeto 1.
Cepas e cultivo
As diferentes formas da cepa Sporotrix schenckii serão obtidas conforme previamente descrito (Fernandes et al., 2000). A forma de levedura será obtida através de cultivo em meio Brain Heart Infusion (BHI) (Sigma-Aldrich, Brasil) a 37 °C (150 RPM) por 7 dias.
Desenvolvimento da quimera rchiSsEno-Gp70
As proteínas SsEno e Gp70 foram selecionadas com base em minuciosa revisão bibliográfica de trabalhos científicos. Para a construção da quimera rchiSsEno-Gp70, serão utilizadas as sequências codificadoras (CDS) das proteínas SsEno e Gp70 depositadas no GenBank (ERS97971.1 e ERS98762.1, respectivamente) oriundas da cepa de Sporothrix schenckii ATCC 58251. As sequencias de aminoácidos destas proteínas serão analisadas pelas ferramentas e softwares de bioinformática.
Imunização dos camundongos
Serão utilizados camundongos BALB/c (Mus musculus) fêmeas e machos, pesando entre 15 e 20 gramas, com idade em torno de 6 a 8 semanas, procedentes do Biotério Central da UFPel. Antes de iniciar os ensaios, cada animal será identificado individualmente e então serão divididos aleatoriamente em cinco grupos de dez animais cada, conforme descrito a seguir:

(A) rchiSsEno-Gp70 (100 µg);
(B) rchiSsEno-Gp70 (100 µg) + MontanideTM;
(C) rchiSsEno-Gp70 (100 µg) + Hidróxido de Alumínio;
(D) PBS + MontanideTM (controle negativo);
(D) PBS + Hidróxido de Alumínio (controle negativo).

Os animais serão imunizados por via subcutânea (SC) nos dias 0 e 21 com as vacinas de subunidade e seu respectivo controle negativo, os animais receberão duas doses (via SC) com 21 dias de intervalo, contendo 100 µg de proteína adsorvida em Montanide e hidróxido de alumínio (Alhydrogel, BrenntagBiosector, 216145-51-2) como adjuvantes. Aos exatos 51 dias após a primeira dose os animais serão desafiados conforme descrito por (Fernandes et al., 2000) . Brevemente, o desafio será realizado por via intravenosa (IV) com 105 células de leveduras altamente virulentas de Sporotrix schenckii em 0,1 mL de PBS pela veia da cauda. Os animais serão monitorados diariamente durante 40 dias para acompanhar a progressão da doença. Após o término dos experimentos, os animais sobreviventes serão eutanasiados através da anestesia intratecal com pentobarbital 150 mg/kg. Amostras de lesões na pele, pulmões, fígado, baço e linfonodos serão removidas para acessar a carga do fungo, sua disseminação interna nos órgãos e realizar análises histopatológicas conforme protocolo previamente descrito. Em seguida as carcaças serão encaminhadas para incineração.
Avaliação da resposta imune humoral
Amostras de sangue serão coletadas através da punção da veia submandibular antes de cada dose da vacina, desafio e antes da eutanásia para finalização do experimento. O soro será separado por centrifugação e armazenado à -20 °C até a sua utilização.
Avaliação da resposta imune celular
As formulações vacinais com melhor desempenho protetor frente a desafio letal serão utilizadas para imunização de um novo lote de animais. Cerca de 21 dias após a aplicação da segunda dose os animais (10/grupo) serão eutanasiados por sobredose anestésica e o baço será coletado e macerado. . As células do baço (5x106/cavidade) serão cultivadas em meio DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), em triplicata, utilizando placas de cultivo celular com 24 poços.

SUBPROJETO 3 – Avaliação de vacina terapêutica recombinante em gatos acometidos por esporotricose.
Critérios de inclusão dos felinos
Após a execução e avaliação dos resultados do subprojeto 2, serão estudados o total de 40 felinos divididos em dois grupos provenientes dos atendimentos de rotina clínica do Hospital de Clínicas Veterinária (HCV) da UFPEL, do Centro de Controle de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Pelotas e de clínicas veterinárias particulares do município de Pelotas (RS) e região. Todos os animais serão adultos, entre 1 e 8 anos de idade, podendo ser fêmeas ou machos, castrados ou não, independentemente de ser primoinfecção ou infecção recorrente. Serão coletados dados de resenha e da apresentação da esporotricose, além de estado reprodutivo, moradia, contactantes, entre outros. Assim, obtendo um panorama geral das condições de vida e habitat que estes animais adquiriram a infecção. Os animais serão classificados conforme a apresentação clínica das lesões e o estado geral, segundo Schubach et al. (2004) e Miranda (2013). Em relação ao estado geral serão classificados: estado geral bom com ausência de sinais extracutâneos; estado geral regular, com sinais extracutâneos leves; estado geral delicado, com sinais extracutâneos moderados; estado geral crítico, com sinais extracutâneos intensos. A apresentação das lesões se dará da seguinte forma: lesões em apenas um local; lesões em dois locais não contíguos; lesões em três ou mais locais não contíguos. Serão considerados como sinais extracutâneos conjuntivite, desidratação, dispneia, emagrecimento, palidez de mucosas, prostração, entre outros. O animais deverão ter a suspeita clínica confirmada por análise micológica de amostras cutâneas, da qual será feito por citologia e cultura fúngica. Para citologia, serão coletados exsudato das lesões, feito esfregaço em lâminas de microscopia, corados pelo método panótipo e analisados microscopia para procura de células fúngicas compatíveis com fungos do complexo Sporothrix schenckii. Para a cultura fúngica, após a antissepsia local com álcool a 70°GL, serão preconizadas as coletas de crostas, de exsudato e punção aspirativa por agulha fina dos nódulos. As amostras serão armazenadas em frascos estéreis e, imediatamente, encaminhadas sob refrigeração ao laboratório de micologia para cultura e isolamento fúngico, confirmando o diagnóstico de infecção por Sporothrix spp. Os tutores serão conscientizados da vacina terapêutica experimental e aos que aderirem o tratamento serão convidados a assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e o projeto aprovado pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas (CEEA/UFPel).
Imunização em gatos
Serão utilizados vinte e quatro gatos adultos (doze machos e doze fêmeas), naturalmente acometidos por esporotricose e sem comorbidades. Os animais serão dividos em 2 grupos experimentais. O grupo 1 receberá o tratamento convencional oral de Itraconazol (100 mg/gato, 1 x dia), e imunizados com solução salina (Controle negativo). O grupo 2, além do tratamento oral com itraconazol, receberão 100 µg da vacina terapêutica rchiSsEno-Gp70. Os tratamentos tratamentos foram dados em intervalos de 14 dias (nos dias 0, 14, 28, 42, 56 e 70). No dia 0, uma dose dupla (ou seja, 200 µg da vacina) será administrada por via SC no membro pélvico. Todos os seguintes serão administrados por via SC em doses únicas de 1 ml de volume, alternando entre os membros posteriores esquerdo e direito, começando com o membro esquerdo (D. Westhoff et al, 2010).

-Desenvolvimento de um ELISA indireto sensível e específico para o diagnóstico e o estadiamento da esporotricose em felinos;
-Obtenção das vacinas profiláticas recombinantes em diferentes formulações;
-Formulações vacinais avaliadas em camundongos através dos testes de proteção ao desafio;
-Formulações vacinais avaliadas quanto a resposta imune humoral e celular induzidas;
-Elucidação do tipo de resposta imune envolvido na indução de imunidade protetora;
-Avaliação de uma vacina terapêutica em felinos naturalmente acometidos pela esporotricose;
--Formação de recursos humanos altamente qualificados;
-Publicação de artigos científicos em periódicos especializados e depósito de patentes.
Os resultados parciais obtidos serão divulgados em congressos científicos. Com o desenvolvimento do projeto, espera-se gerar, no mínimo, a produção de quatro artigos científicos veiculados em periódicos de circulação internacional. Há ainda a expectativa de obtenção de um produto o qual deverá ser protegido através do patente. Com relação as publicações para o público em geral, o grupo realiza publicações semanais em página própria em rede social, link: https://www.instagram.com/clinpet.ufpel, direcionada a tutores de animais, médicos veterinários e estudantes de graduação. Este projeto fará parte de dissertações de mestrado e teses de doutorado e possibilitará também a formação de recursos humanos.