Nome do Projeto
Atividade anti-Pythium insidiosum do gás ozônio e avaliação da ozonioterapia como uma estratégica terapêutica na pitiose em equinos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/06/2022 - 31/05/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Pythium insidiosum é um importante oomiceto patógeno de mamíferos que causa a pitiose, uma doença endêmica em regiões de clima quente, sendo frequente em humanos na Tailândia e equinos no Brasil. A pitiose destaca-se pelo prognóstico desfavorável, letalidade nas espécies afetadas e dificuldades de tratamento. Embora os estudos envolvendo protocolos para o tratamento da enfermidade tenham aumentado na última década, observa-se que ainda não há um tratamento padrão que determine a cura rápida e eficaz da enfermidade. Sendo assim, a pitiose permanece sendo uma infecção de difícil tratamento e muitos indivíduos afetados morrem ou necessitam de eutanásia. Neste sentido, é imprescindível o incremento de pesquisas que busquem terapias inovadoras e eficientes para o tratamento da enfermidade nos mamíferos. Desta forma, neste projeto propõe-se verificar a eficácia in vitro e in vivo da ozonioterapia como alternativa terapêutica e integrativa na pitiose. Para avaliar a ação inibitória do gás ozônio, frascos com 30 mL de meio de indução contendo 103-104zoósporos/mL e frascos contendo um grama de micélio de P. insidiosum (n=22) serão submetidos ao borbulhamento com gás ozônio na concentração de 71µg/mL/5minutos e incubados a 37ºC/96hrs. Imediatamente após o borbulhamento com o gás e a cada 24 horas, durante 96 horas, uma alíquota de micélio e zoósporos será transferida para ágar levedura 0,1% e incubada a 37ºC/96 horas. Análises de microscopia eletrônica de varredura e de transmitância serão realizadas para avaliar os danos celulares causados pelo gás ozônio sobre células de P. insidiosum. Adicionalmente, a ação inibitória do óleo de girassol ozonizado, bem como do gás ozônio será avaliada sobre fragmentos de kunkers oriundos de lesões clínicas de equinos. A eficácia da ozonioterapia no tratamento da pitiose em equinos será realizada em propriedades rurais da região sul do estado do RS. Os equinos com pitiose clínica serão tratados com ozonioterapia na forma de bagging, ozonioterapia sistêmica por insuflação retal e na forma tópica com óleo de girassol ozonizado aplicado diretamente sobre a lesão na forma de bandagem até a recuperação da lesão.

Objetivo Geral

Avaliar in vitro a atividade anti-P. insidiosum do gás ozônio e verificar a eficácia da ozonioterapia como alternativa terapêutica na pitiose em equinos.

Justificativa

O gênero Pythium compreende mais de 140 espécies de oomicetos termofílicos, ubíquos em ecossistemas lênticos e terrestres de regiões de clima temperado (Kageyama 2014). Enquanto alguns gêneros de oomicetos são sapróbios, outros são patógenos, podendo causar infecções em plantas (Pythium e Phytophthora), insetos (LagenidiumePythium), peixes (Achlya, SaprolegniaePythium) e mamíferos (LagenidiumePythium) (Mendoza; Villela, 2013). A espécie Pythium insidiosum é patógeno de mamíferos, causando a pitiose, uma doença grave, de rápida evolução e difícil tratamento (Gaastra et al., 2010). Embora a pitiose seja descrita em vários países (Mendoza et al., 1996), o maior número de casos é relatado na Tailândia em humanos (Krajaejun et al., 2006, Reanpang et al., 2015) e em equinos no Brasil, sendo que as regiões brasileiras de maior relevância incluem o Pantanal, o Sul do Rio Grande do Sul (RS) e o Nordeste brasileiro que são endêmicas para a infecção, com prevalências estimadas em 12,5% (Santos et al., 2014), 14,5% (Marcolongo-Pereira et al., 2012; Weiblen et al., 2015) e 15,17% (Souto et al., 2021), respectivamente.
Como típico oomiceto aquático, P. insidiosum realiza parte de seu ciclo biológico em águas de rios, lagoas e lagos. Dentro deste habitat são mais comumente encontrados nas águas rasas próximas às margens (Alexopoulos et al., 1996). O acúmulo de água estagnada e temperaturas ambientais entre 30℃ a 40℃ favorecem a reprodução assexuada que origina zoósporos móveis que constituem a forma infectante do micro-organismo. Esses zoósporos são atraídos para o pelo dos animais, penetram na pele e produzem a enfermidade (Mendoza et al., 1996). A presença de P. insidiosum em áreas alagadiças foi demonstrada por Miller (1983) em áreas pantanosas da Austrália; Supabandhu et al. (2008) em reservatórios de água utilizados para irrigação de lavouras na Tailândia; Presser&Goss (2015) nos EUA e por Zambrano et al. (2017) em ambientes pantanosos no estado brasileiro do Rio Grande do Sul. Na pitiose em animais, comumente observa-se que as lesões cutâneas nas espécies afetadas ocorrem em regiões que estão em maior contato com a água (Mendoza et al., 1996), o que é justificado pelo ciclo biológico de P. insidiosum.
Pitiose merece destaque pela dificuldade de tratamento e letalidade nas espécies afetadas. Embora, nos últimos anos, os estudos envolvendo protocolos terapêuticos para o tratamento da enfermidade tenham avançado significativamente, a pitiose permanece sendo uma infecção difícil de tratar e muitos indivíduos afetados morrem em decorrência de complicações ligadas à enfermidade ou necessitam de eutanásia. Parte dos insucessos terapêuticos deve-se a deficiente resposta de P. insidiosum às terapias disponíveis, incluindo tratamento com fármacos antifúngicos, cirurgia e imunoterapia (Gaastra et al., 2010).
A cirurgia é o método mais antigo e comumente empregado no tratamento da pitiose em animais e no homem, todavia, taxas de recidiva em torno de 45% são relatadas (Gaastra et al., 2010). Além disso, este procedimento é muitas vezes impedido pelas estruturas anatômicas envolvidas, principalmente os membros na pitiose em equinos (Miller, 1981) e, em muitos casos, requer a amputação e/ou excisão da região afetada na doença em humanos (Krajaejun et al., 2006, Reanpang et al., 2015, Permpalung et al., 2019).
A imunoterapia surgiu em 1981 (Miller, 1981) como uma alternativa para o tratamento da pitiose equina e tem sido utilizada até os dias atuais. Embora seja considerada uma prática segura, com índices de cura de aproximadamente 60-70% em equinos e humanos, há muitos casos que não respondem ao imunoterápico (Mendoza; Newton, 2005).
As pesquisas avaliando opções terapêuticas com fármacos antimicrobianos, incluindo prospecção de fármacos empregando compostos antifúngicos, antibacterianos, óleos essenciais de plantas, entre outros, apresentou um incremento considerável nos últimos anos, mostrando resultados animadores in vitro. No entanto, quando aplicados na pitiose clínica ou experimental nem sempre os resultados foram satisfatórios (Pereira et al., 2007; Argenta et al., 2012; Fonseca et al., 2015; Zanette et al., 2014; Jesus et al., 2016). Recentemente, Ramappa et al. (2017), Ross Castelar (2017) e Bagga et al. (2018) relataram a cura da pitiose ocular em humanos com o uso de azitromicina, minociclina e linezolida. Todavia, em medicina veterinária e, particularmente na pitiose em equinos, o emprego desses fármacos torna-se inviável em função da alta dose a ser empregada o que torna oneroso os custos do tratamento. Desta forma, é imprescindível a continuidade de pesquisas que busquem outras terapias para o tratamento da enfermidade nos animais, principalmente em equinos.
A ozonioterapia é uma técnica da medicina integrativa que agrega a utilização de 95% de O2 e 5% de O3, podendo ser o gás empregado na forma sistêmica (insuflação retal, auto-hemoterapia maior, auto-hemoterapia menor, auto-hemoterapia intermediária e fluidoterapia ozonizada); local (infusão perilesional, cupping, bagging e água ozonizada) e tópica quando utilizado o óleo ozonizado. O óleo ozonizado tem vantagem sobre a forma gasosa e líquida de ozônio, pois o veículo se mantém em contato com as superfícies, exercendo suas funções por um período superior (López et al., 2003; Bocci, 2005). Além disso, enquanto a meia vida do ozônio sob a forma gasosa é efêmera, sob a forma de óleo pode ser estocado por vários meses, dispensando a necessidade de gerador, o que reduz custos (Bocci, 2005, Jorge et al., 2006).
Relata-se que o ozônio ativa o sistema antioxidante do organismo, aumenta a imunidade e melhora a perfusão sanguínea, o que explica sua ação antimicrobiana, antineoplásica, anti-inflamatória e analgésica (Rodríguez et al., 2018). Estudos sugerem que o ozônio causa lesões na parede celular das bactérias, o que leva a morte desses procariotos (Dähnhardtet al., 2006). Adicionalmente, acredita-se que a sua difusão para o interior das células causa a oxidação de aminoácidos e ácidos nucleicos, impedindo a replicação celular e síntese de aminoácidos, levando à desnaturação e morte dos micro-organismos (Sunnen, 1998; Velano et al., 2001).
Em medicina veterinária, a ozonioterapia tem sido empregada para o tratamento de diversas enfermidades incluindo infecções bacterianas, fúngicas, virais, parasitárias, entre outras (Rodríguez et al., 2018, Quintana et al., 2019). Zambrano et al. (2019) evidenciaram a atividade in vitro anti-P. insidiosum do óleo de girassol ozonizado, bem como demonstraram que o crescimento do oomiceto foi inibido após a exposição de kunker com óleo ozonizado. Adicionalmente, Ferreira et al. (2021) relataram a ação antimicrobiana in vitro de diferentes preparações do gás ozônio sobre P. insidiosum.
Acreditamos que a ozonioterapia pode ser empregada na terapia integrativa da pitiose equina, bem como de outras enfermidades causadas por fungos e bactérias, reduzindo o curso clínico da doença. Estudos preliminares desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa têm evidenciado os benefícios da ozonioterapia sistêmica e tópica no tratamento de equinos com pitiose cutânea (Zambrano et al., 2020). Contudo, o ozônio não deve constar apenas como uma medida paliativa ou inespecífica de tratamento, devendo ser profundamente estudado os seus mecanismos de ação e doses terapêuticas compreendidas cientificamente, para que aliado às terapias convencionais possibilite resultados clínicos expressivos em menor tempo, diminuindo custos e representando uma alternativa terapêutica a ser empregada na prática clínica.
O crescente aumento do número de casos de pitiose em animais e no homem e as dificuldades encontradas para a cura da doença têm impulsionado muitas pesquisas em pitiose; especialmente, direcionadas para o desenvolvimento de novas tecnologias que buscam maior eficácia e ao mesmo tempo sejam economicamente viáveis e ambientalmente comprometidas. Como pesquisadores engajados na área de micologia veterinária, a equipe que propõe o presente estudo, visa corroborar na produção de novos conhecimentos científicos e na busca de tecnologias viáveis que possam ser aplicadas ao tratamento e controle da pitiose em medicina veterinária, podendo ser também aplicada à pitiose em humanos. As informações originadas neste trabalho poderão ser utilizadas na clínica veterinária como uma terapia combinada e auxiliar à pitiose, proporcionando benefícios ao setor produtivo do País, especialmente à equinocultura. Os resultados gerados ao final deste trabalho servirão de sustentação para o desenvolvimento de outros estudos nesta linha de pesquisa podendo contribuir expressivamente para o desenvolvimento técnico-científico do Brasil.

Metodologia

Isolados de P. insidiosum:
Serão utilizados 20 isolados de P. insidiosum, oriundos de animais naturalmente infectados, provenientes do estado do Rio Grande do Sul e 01 proveniente do Uruguai, processadas pelo Laboratório de Micologia (LABMIC) (Instituto de Biologia – Universidade Federal de Pelotas) e duas cepas-padrão (CBS101555, CBS57585). Todas as amostras serão mantidas em tubos contendo ágar Corn Meal Agar (CMA) à temperatura ambiente. Os isolados clínicos estão devidamente registrados no SISGen (A07F9A9).

1) Atividade antimicrobiana do gás ozônio sobre o micélio de P. insidiosum
Todos os experimentos in vitro com gás ozônio serão realizados empregando o gerador de ozônio portátil Medplus MX (Philozon), registrado na Anvisa.

1.1) Avaliação do gás ozônio sobre micélio em bagging: Esta metodologia foi baseada em Ferreira et al. (2021) com modificações. Para os tratamentos serão empregadas duas concentrações de gás ozônio: T1 - 51 µg/mL e T2 - 71 µg/mL aplicadas em três tempos de exposição diferentes: 5, 10 e 15 minutos. A partir do cultivo micelial de P. insidiosum (n=5), em caldo Sabouraud, em estufa de agitação orbital, a 37ºC/72 horas, uma grama do micélio será transferida para placas de ágar levedura 0,1%. As placas serão acondicionadas em sacos plásticos apropriados, os quais serão devidamente fechados e insuflados com o gás ozônio nas diferentes concentrações (T1 - 51 µg/mL e T2 - 71 µg/mL) e tempos de exposição (5, 10 e 15 minutos para cada concentração). Posteriormente, as placas serão retiradas dos sacos plásticos e incubadas a 37ºC. Após 48 horas e 96 horas, uma nova insuflação de gás, empregando as mesmas concentrações de T1 e T2 e tempos de exposição será realizada nas placas de cada tratamento. A cada 24 horas até completar 7 dias de incubação a 37ºC, o crescimento micelial será avaliado pela medida do diâmetro da colônia. As medidas serão anotadas em planilha e posteriormente submetidas a análise estatística. Para cada concentração de gás ozônio avaliada e tempo de exposição serão realizadas três repetições por tratamento. Três placas controle (cultivo micelial de P. insidiosum sem tratamento) serão incluídas em cada tratamento.

1.2) Avaliação do gás ozônio sobre o micélio de P. insidiosum em borbulhamento em meio de indução: P. insidiosum (n=23) será crescido em caldo Sabouraud em estufa de agitação orbital a 37ºC/72hrs. Após o crescimento micelial, um grama do micélio será transferido para tubos tipo Falcon contendo 30mL de meio de indução e gás ozônio será insuflado com borbulhamento no interior dos frascos, empregando a concentração de 71 µg/mL de gás, durante cinco minutos. Os frascos serão incubados, em agitação orbital, a 37ºC/96 horas. Imediatamente após a insuflação do gás e a cada 24 horas, durante 96 horas, uma alíquota de micélio será transferida para placas de Petri contendo ágar levedura 0,1%, sendo incubada a 37ºC/96 horas. O experimento será realizado em duplicata e com duas repetições. Como controle positivo será utilizado um frasco do oomiceto contendo micélio de P. insidiosum sem tratamento com gás ozônio.

1.3) Atividade antimicrobiana do gás ozônio sobre zoósporos de P. insidiosum em borbulhamento em meio de indução
P. insidiosum (n=23) será submetido a técnica de zoosporogênese para produção de zoósporos, conforme previamente descrito por Pereira et al. (2007). Após a contagem de zoósporos (aproximadamente 103 a 104 zoósporos/mL), gás ozônio será insuflado com borbulhamento no interior dos frascos contendo 30 mL de meio de indução, empregando a concentração de 71 µg/mL de gás, durante cinco minutos. Os frascos serão incubados, em agitação orbital, a 37ºC/96 horas. Imediatamente após a insuflação do gás e a cada 24 horas, durante 96 horas, uma alíquota de 100µL do meio de indução será transferida para placas de Petri contendo ágar levedura 0,1%, sendo incubada a 37ºC/96 horas. O experimento será realizado em duplicata e com duas repetições. Como controle positivo será utilizado um frasco do oomiceto contendo zoósporos de P. insidiosum sem tratamento com gás ozônio.

1.4) Microscopia eletrônica para avaliação das alterações morfológicas e danos ocasionados pelos compostos estudados nas células de P. insidiosum
As análises serão realizadas através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmitância (MET) no Centro de Microscopia Eletrônica do Sul (CEME - SUL) da Universidade Federal de Rio Grande (FURG).
Para avaliação das alterações morfológicas e danos ocasionados pelo gás ozônio, após exposição do micélio de P. insidiosum ao gás, uma alíquota do micélio será coletada imediatamente e outra alíquota após 24 horas de incubação a 37ºC, sendo as amostras devidamente preparadas para a análise de MEV e MET, seguindo o protocolo previamente descrito por Valente et al. (2019) e Ianiski et al (2020). Adicionalmente, os controles (sem exposição ao gás) também serão submetidos a MEV e MET.

2) Ensaios de suscetibilidade ex vivo:
Neste experimento será avaliada a atividade antimicrobiana do óleo de girassol, do OGO (Philozon), óleo de oliva e OLO (Philozon), bem como será analisado o efeito do gás ozônio sobre o crescimento de P. insidiosum a partir de kunkers oriundos de pitiose clínica em equinos.
Os kunkers oriundos de pitiose equina enviado ao laboratório de micologia para análise, serão cortados em pequenos fragmentos e lavados, durante 10 minutos, em uma solução contendo antimicrobianos (Pentabiótico Reforçado®). Posteriormente serão lavados com água destilada estéril e seis fragmentos de kunkers serão distribuídos em placas de Petri contendo agar levedura 0,1%, constituindo os seguintes grupos:
- Grupo 1 (controle): placas contendo fragmentos de kunkers sem tratamento;
- Grupo 2 (kunkers+óleo de girassol ou óleo de oliva): placas contendo fragmentos de kunkers sobre os quais será dispensado um volume de 50µL do óleo de girassol ou óleo de oliva;
- Grupo 3 (kunkers+OGO ou OLO): placas contendo fragmentos de kunkers sobre os quais será dispensado um volume de 50µL do OGO ou OLO;
- Grupo 4 (kunkers+aplicação de gás ozônio): placas contendo fragmentos de kunkers sobre os quais será insuflado gás ozônio na concentração de 51µg/mL, durante 20 minutos (sendo 10 minutos com aparelho de gerador de ozônio ligado e 10 minutos desligado).
Cada grupo será avaliado em duplicata. Todas as placas ficarão incubadas em estufa a 37ºC, durante 96 horas, sendo avaliadas diariamente.

3) Avaliação da ozonioterapia em equinos com pitiose clínica:
Este experimento com equinos foi aprovado pelo comitê de ética e experimentação animal da UFPel (CEEA) sob o número 28332-2019.
Baseados na epidemiologia da pitiose no Rio Grande do Sul e nos estudos de campo realizados pelo nosso grupo de pesquisa (Marcolongo-Pereira et al., 2012; Weiblen et al., 2015; Zambrano et al., 2020) este experimento foi desenhado para o estudo da ozonioterapia, como uma metodologia de medicina integrativa, em equinos naturalmente acometidos pela pitiose. Esta pesquisa será realizada em propriedades rurais da região sul do estado do RS. Os equinos com pitiose clínica serão tratados com ozonioterapia na forma de bagging (uma vez na semana/durante 30 dias), ozonioterapia sistêmica por insuflação retal, empregando-se gás ozônio nas concentrações variáveis de 15-20µg/mL, durante 4 minutos, 1 vez na semana. Alternadamente, a ozonioterapia sistêmica será aplicada pela via de auto-hemoterapia menor, empregando-se gás ozônio na concentração 53µg/mL, 1 vez na semana. Adicionalmente, OGO será aplicado topicamente sobre a lesão, na forma de bandagem, até a recuperação da lesão. A ozonioterapia será realizada empregando o gerador de ozônio portátil Medplus MX (Philozon), registrado na Anvisa.
Todos os equinos serão previamente examinados, realizando-se o exame clínico geral, coleta de sangue para realização de hemograma e procedimento cirúrgico para retirada de excesso de tecido de granulação (quando necessário) e coleta de kunkers para o isolamento de P. insidiosum. Durante o tratamento, os animais permanecerão em suas propriedades de origem até completa recuperação. As lesões serão avaliadas semanalmente quanto a regressão, regeneração tecidual e cicatrização, sendo estabelecida uma planilha de pontuação.

Indicadores, Metas e Resultados

Com o desenvolvimento do projeto, espera-se dispor de resultados promissores que possam ser aplicados como terapias integrativas e combinadas no tratamento de lesões de pitiose em animais. Adicionalmente, estas terapias poderão ser extensivas ao tratamento da pitiose em humanos. A proposta do emprego de ozonioterapia para o tratamento da pitiose é inovador. Os dados gerados neste estudo servirão de alavanca para a realização de outras pesquisas, consolidando desta forma, uma linha de pesquisa envolvendo a suscetibilidade de P. insidiosum empregando novas tecnologias.
A publicação dos resultados, em periódicos da área e encontros científicos (espera-se gerar, no mínimi 02 artigos científicos), possibilitará a divulgação dos conhecimentos obtidos. Adicionalmente, o envolvimento de um doutor Pós-Doc, bem como de estudantes de graduação e pós-graduação, resultará na capacitação técnica e na formação de recursos humanos de profissionais, especialmente nas áreas de Medicina Veterinária e Microbiologia aplicada/Micologia

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
AUGUSTO DUARTE BROD
CAROLINE QUINTANA BRAGA
CRISTINA GOMES ZAMBRANO
DANIELA ISABEL BRAYER PEREIRA1
ISABELLA RODRIGUES DE ANDRADE
JÚLIA DE SOUZA SILVEIRA
Sônia de Avila Botton

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