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Pythium insidiosum pertence ao filo Oomycota que inclui diversos gêneros tais como: Pythium, Phytophthora, Hyaloperonospora, Albugo, Saprolegnia e Aphanomyces (Kwon-Chung, 1994). Dentre esses gêneros, Pythium spp. é capaz de infectar mamíferos domésticos e selvagens, bem como o homem, causando uma doença grave e de difícil tratamento denominada pitiose (Gaastra et al., 2010). P. insidiosum apresenta similaridades morfológicas com os fungos verdadeiros, porém em sua classificação taxonômica está mais próximo das algas diatomáceas do que dos fungos (Teng et al., 2019). Diferentemente da resistência fúngica e bacteriana induzida pelo uso indiscriminado de fármacos, P. insidiosum, um pseudo-fungo, por possuir parede celular com composição química diferente dos fungos verdadeiros, apresenta muitas vezes baixa suscetibilidade aos fármacos antimicrobianos disponíveis para o tratamento de infecções fúngicas (Mendoza et al., 2013).
A pitiose é uma doença grave, com risco de morte, de relevância na medicina veterinária e humana (Gaastra et al. 2010). Dentre as espécies domésticas, a enfermidade assume importância econômica na criação de equinos, sendo o Brasil o país com o maior número de casos relatados nessa espécie (Marcolongo-Pereira et al., 2012; Santos et al., 2014; Souto et al., 2021). Por outro lado, a pitiose em humanos é frequente no continente asiático, particularmente na Tailândia e apresenta elevadas taxas de letalidade (Hilton et al., 2016). Em todas as espécies acometidas a enfermidade tem prognóstico desfavorável e os protocolos terapêuticos disponíveis, incluindo cirurgia, imunoterapia e fármacos antimicrobianos nem sempre resultam na cura da doença (Gaastra et al., 2010).
Devido às frequentes falhas terapêuticas e às dificuldades encontradas no tratamento da pitiose, na última década diversas pesquisas foram desenvolvidas no sentido de buscar novas possibilidades terapêuticas para a doença. Esses estudos avaliaram a atividade anti-P. insidiosum de fármacos com atividade antibacteriana (Itaqui et al., 2016; Jesus et al., 2016; Ramappa et al., 2017; Ross Castelar et al. 2017; Bagga et al., 2018; Loreto et al., 2018); antifúngica, como caspofungina, micafungina, terbinafina (Pereira et al., 2007; Argenta et al., 2012; Zanette et al., 2015; Jesus et al., 2016; Itaqui et al., 2016), antiparasitário como miltefosina (Loreto et al., 2018), óleos essenciais de plantas medicinais e compostos naturais (Fonseca et al., 2015; Araujo et al., 2016; Valente, 2016; Trolezi et al., 2017), bem como compostos nanoestruturados incluindo nanopartículas biogênicas de prata e nanoemulsão de Melaleuca alternifolia (Valente et al., 2019; Valente et al., 2020, Valente et al., 2022). Contudo, P. insidiosum é um micro-organismo difícil de tratar, sendo imprescindível o desenvolvimento de pesquisas por novas terapias, incluindo a continuidade da busca por reposicionamento de fármacos, bem como suas associações para o tratamento desta enfermidade emergente que acomete os mamíferos.
Considerando às dificuldades encontradas para o tratamento efetivo de infecções causadas pelo oomiceto P. insidiosum, e como ainda, não há um protocolo terapêutico estabelecido tanto para uso em humanos quanto em animais; a pesquisa por alternativas eficazes para contornar esse desafio torna-se indispensável para o controle da pitiose nas espécies acometidas.

Isolados de P. insidiosum
Serão utilizados trinta (30) isolados de P. insidiosum, oriundos de animais naturalmente infectados, constituintes da pitioteca do Laboratórios de Micologia (LABMICO/Universidade Federal de Pelotas/UFPel) e as seguintes cepas-padrão: CBS101555, CBS57585, CBS57685, CBS67385, CBS70283, CBS77784, CBS119453, CBS119454 e CBS119455. Todos os isolados de P. insidiosum, constituintes da pitioteca, estão devidamente registrados no SISGEN (A07F9A).

Obtenção dos compostos farmacológicos e preparação do inóculo para testes in vitro
Daptomicina, polimixina B e gemifloxacina serão obtidos comercialmente. Os testes in vitro serão realizados utilizando como inoculo hifas de P. insidiosum, segundo metodologia padronizada por Fonseca et al. (2014).

Ensaios de suscetibilidade in vitro
O teste a ser utilizado compreenderá o método de microdiluição em caldo, seguindo as normas descritas no documento M38-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008). A partir da solução-estoque dos antimicrobianos a serem analisados, serão preparadas diluições sucessivas em meio RPMI. Alíquotas de 100µl dessas concentrações serão dispensadas sequencialmente nas microplacas, preenchendo os poços pertencentes às colunas numeradas de um a dez. A estas colunas será distribuído um volume de 100µl do inóculo. Para cada teste serão utilizadas colunas controle positivo e negativo. As placas serão incubadas a 37°C em estufa orbital de agitação constante a 75 rpm, durante 48 horas. Todos os testes serão realizados em triplicata e em duas repetições. A leitura levará em consideração o crescimento ou não de hifas, sendo identificada a concentração inibitória mínima (CIM), ou seja, a menor concentração em que não houver o crescimento de hifas. As concentrações acima da concentração inibitória mínima serão utilizadas para determinação da concentração oomicida mínima (COM). Para isto, 100 μl da diluição serão transferidos para tubos contendo 900 μl de caldo Sabouraud, ficando incubados a 37ºC por 24 horas. A menor concentração do antimicrobiano avaliado que não evidenciar crescimento será considerada a COM.

Microscopia eletrônica para avaliação das alterações morfológicas e danos ocasionados pelos compostos estudados nas células de P. insidiosum
As análises serão realizadas através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmitância (MET) no Centro de Microscopia Eletrônica do Sul (CEME - SUL) da Universidade Federal de Rio Grande (FURG).
Para avaliação das alterações morfológicas e danos ocasionados pelos fármacos será utilizada a concentração sub-letal (anterior à CIM) dos compostos avaliados. Adicionalmente, os controles (sem tratamento) também serão submetidos a MEV e MET.
Para o preparo das amostras para a MEV será adicionado em um tubo tipo eppendorf 0,3ml da amostra (de cada concentração a ser avaliada e os controles), 1 ml de glutaraldeído 3% em tampão fosfato 0,05 M pH 6,8 e mantidas a 4ºC por 48 h. Após esse período cada tubo será centrifugado durante 5 min a 8000 rpm e descartado o sobrenadante. Será adicionado 1 ml de H2O, agitado em vortex por 20 s e centrifugado durante 5 min a 8000 rpm (Repetindo o procedimento 3 vezes). Após, o precipitado será lavado com soluções de etanol (30, 50, 70 e 95%) e cada tubo será agitado em vortex por 20 s e centrifugado durante 5 min a 8000 rpm, entre cada lavagem sempre descartando o sobrenadante. Após isso será feita a lavagem do pellet com etanol 95% deixar em etanol puro (100%) por 15 min e centrifugada a amostra durante 5 min a 8000 rpm. O pellet será colocado em uma placa de Petri deixando secar em estufa a 30 °C por 3 horas. Após a secagem as amostras serão colocadas em stubs e cobertas com ouro-paladio (60 s, 1,8 mM, 2,4 kV), sendo visualizadas a 25 kV de 400 a 5.000 x magnitude (Valente et al., 2019). Para a MET as amostras serão centrifugadas a 3500g/10 min.; o sobrenadante desprezado e a amostra lavada com 0.1 moll MgSO4 buffer; sobrenadante desprezado. Posteriormente, será realizada a fixação com glutaraldeído 3% cacodilato buffer (pH 7.2), over night a 4°C. Em sequência as amostras serão lavadas 3 vezes consecutivas com cacodilato buffer e incubadas com em solução de 2% de permanganato de potássio por 1 hora a 4ºC. As amostras serão lavadas com água destilada (3 lavagens consecutivas) e pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio (OsO4), over night a 4ºC. Posteriormente, serão desidratadas em gradiente de etanol (30 a 100%) e acetona e embebidas em resina epoxy (Valente et al., 2019).

Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que os fármacos reposicionados apresentam ação inibitória sobre P. insidiosum. Desta forma, o avanço das pesquisas buscando estratégias de reposicionamento de fármacos que possam ser aplicados ao tratamento da pitiose são imprescindíveis, uma vez que trazem novas perspectivas de terapia desta importante enfermidade que acomete os animais e o homem. Espera-se que os fármacos avaliados nesta pesquisa apresentem potencial atividade anti-P. insidiosum.
A publicação dos resultados, em periódicos da área e encontros científicos, possibilitará a divulgação dos conhecimentos obtidos. Adicionalmente, o envolvimento de um doutor Pós-Doc, bem como de estudantes de graduação e pós-graduação, resultará na capacitação técnica e na formação de recursos humanos de profissionais, especialmente nas áreas de Medicina Veterinária e Microbiologia aplicada/Micologia.