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Considerando a importância da bartonelose não somente para a espécie felina, mas para outras espécies de mamíferos, e ainda, o potencial zoonótico da doença, e as atuais dificuldades encontradas no que tange ao diagnóstico e tratamento da mesma, torna-se necessário estudar e desenvolver novas possibilidades, buscando aperfeiçoar e aprimorar o diagnóstico desta enfermidade.

3.1 Locais de estudos
A pesquisa será desenvolvida em conjunto na Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), no LABBio- Laboratório de Bacteriologia e Bioensaios no Instituto de Biologia (UFPel) em parceria com o Programa de Pós Graduação em Microbiologia e Parasitologia - PPGMPar – UFPel e com o Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz) – Rio de Janeiro.
No LABBio- Laboratório de Bacteriologia e Bioensaio foram produzidas as proteínas recombinantes contendo epítopos antigênicos de B. henselae, denominadas Q1, Q2 e Q3. No mesmo laboratório, serão desenvolvidos testes de ELISA e Western Blot, utilizando as 3 proteínas quiméricas, testando-as em amostras de soros felinos, para avaliar a presença de infecção por B. henselae. Estas amostras de soros felinos serão provenientes do Ambulatório Ceval, Hospital de Clínicas Veterinárias, e clínicas veterinárias particulares, que foram inicialmente coletadas para determinar o status de saúde dos felinos que vieram para as consultas.
As proteínas serão caracterizadas por Western blotting, bem como sua atividade de reconhecimento anti-Bartonella, em amostras de soros felinos para avaliar a presença de infecção por B. henselae.
As amostras de soro felino serão submetidas ao teste ELISA indireto, para avaliar a atividade antigênica de reconhecimento de B. henselae das proteínas Q1, Q2 e Q3 diante das amostras de soro felino, utilizando o anticorpo anti-IgG felino conjugado com peroxidase (RheaBiotech), como anticorpo secundário.
As amostras reagentes ao teste ELISA serão encaminhadas ao Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz) – Rio de Janeiro, para realização da contraprova com técnicas de diagnóstico padrão-ouro.

3.2 Coletas e análises das amostras

O estudo será realizando utilizando soros de pacientes felinos, atendidos na rotina do Ambulatório Veterinário Ceval e HCV – FV – UFPel, que foram submetidos previamente a coleta de material para exames hematológicos ou bioquímicos.
Serão incluídos na pesquisa, amostras de soros de gatos, que foram coletadas, de pacientes de ambos os sexos, de qualquer faixa etária. Será realizada avaliação das fichas de atendimento dos pacientes positivos e verificado se consta informações da presença ou ausência de pulgas.

3.3 Armazenamento das amostras

As amostras coletadas previamente, serão mantidas congeladas em freezer -70OC, sendo estas provenientes de atendimentos anteriores de gatos que vieram para consulta clínica na rotina anteriormente e foram armazenadas no Ambulatório Veterinário Ceval e Laboratório de Patologia Clínica da Favet - UFPel.


3.5 Protocolo padrão para realização dos ELISAs indireto

Todas as amostras selecionadas para avaliação serão processadas no Laboratório do Grupo Fitopeet e Laboratório de Bacteriologia e Bioensaios no Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, sendo realizada a técnica de ELISA para detecção de bartonelose em felinos através do uso de proteínas recombinantes contendo epítopos antigênicos de B. henselae
Placas de poliestireno de 96 cavidades de fundo chato NUNC Polysorp (Thermo Scientific) serão sensibilizadas por 16 horas a 4 ºC, com quatro diferentes quantidades de cada antígeno por poço (50ng, 100ng, 150ng e 200ng), diluídos em tampão carbonato-bicarbonato com pH=9,6. Os soros serão testados em duplicatas utilizando a quantidade de 50 μL em cada cavidade. Logo após, a placa foi incubada a 37 ºC por 1 hora. Os soros utilizados foram diluídos em 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 e 1:800 para o checkerboard. Após isso, foi adicionado 50 μL por poço do anticorpo anti-IgG felino conjugado com peroxidase, diluídos em PBS-T em 1:100000, 1:8000, 1:6000, 1:4000, 1:2000, 1:1000 e 1:500. Posteriormente, as reações serão reveladas com o substrato o-fenilenodiamnina (OPD), adicionado de peróxido de hidrogênio, e a placa será armazenada no escuro por 15 minutos. A absorbância foi avaliada a 450 nm usando um leitor de placas de ELISA. Entre as diferentes etapas, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS-T (0,05% de Tween 20).

3.7 Análises Estatísticas
A análise estatística será realizada após a obtenção dos resultados, sendo ainda a ser definido o melhor teste para análise e comparação dos resultados. Para todos os testes será considerado o nível de significância de p<0,05.

. Quantificação e caracterização das proteínas estudadas (Q1, Q2 e Q3);
. Realização de técnica Western Blot;
. Teste de padronização do conjugado (anticorpo anti-cat) – ELISA;
. Teste de padronização do antígeno (soros felinos) – ELISA;
. Padronização da técnica ELISA -utilizando as proteínas, os soros felinos infectados e hígidos e o anticorpo conjugado anti-cat;