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: Avaliar a situação epidemiológica da ocorrência das doenças reprodutivas é fator fundamental para a manutenção da sanidade dos rebanhos. Conhecer a evolução dos agentes etiológicos ao longo do tempo pelo monitoramento de suas prevalências e os fatores de risco envolvidos frente aos agentes patogênicos em rebanhos com distintos programas sanitários é uma ferramenta muito válida para o manejo sanitário eficaz. Determinar a prevalência dos agentes aliada a identificação das diferentes cepas virais e das sorovares de leptospira mais prevalentes têm impacto direto na elucidação da ocorrência das falhas reprodutivas, e na implicação destas variações nos protocolos vacinais atualmente recomendados. Do mesmo modo, a constatação que existe a possibilidade da transmissão do N. caninum via gametas em doadores reagentes exigirá uma mudança nos protocolos sanitários de multiplicação genética. O fortalecimento do uso das medidas de biosseguridade interna e externa na bovinocultura leiteira assegura a sustentabilidade dos sistemas de produção.

1. Coleta das amostras sanguíneas e realização do questionário epidemiológico nos rebanhos leiteiros

Descrição: As amostras de sangue serão coletadas através de venopunção da jugular ou coccígea, de fêmeas bovinas em lactação com mais de 24 meses de idade. Será coletado 10 mL de sangue em tubos estéreis individuas, sem anticoagulante, através do sistema à vácuo com agulhas (25 mm x 0,8 mm (21G)). As amostras de sangue serão centrifugadas a 3500 rpm/10 min para a separação do soro e estes armazenados a -20°C para realização dos exames em bateria. Será realizado um questionário epidemiológico em todos os rebanhos amostrados com objetivo de obter informações sobre o manejo sanitário e a ocorrência de problemas reprodutivos observados nos animais selecionados na amostragem. Atenção especial será dada às questões relacionadas aos fatores de risco detectados no projeto EPIREP fase 1. O questionário epidemiológico com seu detalhamento está inserido ao final (anexo) da proposta. A realização dos questionários e as coletas das amostras sanguíneas dos diferentes rebanhos serão realizadas pela equipe do projeto e pela assistência técnica das instituições envolvidas. As amostras encaminhadas a Embrapa Clima Temperado.

Responsável: Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro
Colaboradores: Janaína Fadrique da Silva
Instituição: Centro de Pesquisa Agropecuária de Clima Temperado
Orçamento: * Materiais de Consumo: R$10.000,00


2. Soro prevalência e identificação e quantificação dos fatores de risco das doenças IBR/BVD, neosporose e leptospirose

Descrição: As análises para determinação da prevalência das doenças IBR/BVD e neosporose serão efetuadas com testes imunoenzimáticos ELISA indireto em kits comerciais estabelecidos na rotina e preparados conforme orientações contidas no manual do fabricante. Os diagnósticos serão efetuados nos laboratórios das universidades parceiras. Para o diagnóstico sorológico das infecções virais, como IBR e BVD, as amostras serão analisadas no laboratório de virologia da Faculdade de Medicina Veterinária da UFPel. Os diagnósticos de leptospirose e neosporose serão efetuadas nos laboratórios do Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Núcleo Biotecnologia e Departamento de Zoonoses da UFPel. São estimadas as análises de 436 amostras provenientes da área geográfica do estudo. Para análise dos fatores de risco serão avaliados os resultados das análises sorológicas e os questionários epidemiológicos dos rebanhos.
Serão realizadas análises bivariadas para testar associações entre cada variável independente do modelo de regressão logística (fatores de risco). O “Teste t” será usado para variáveis contínuas e o Teste Quiquadrado para variáveis categóricas. Os critérios de decisão para a escolha dos fatores de risco serão aqueles que oferecer explicação biológica coerente para presença da doença que na associação apresentaram p<0,20. Após a seleção das possíveis variáveis independentes será aplicada uma série de modelos de regressão logística tendo como variável dependente (variável resposta) o resultado do método de diagnóstico, e como variáveis independentes os fatores anteriormente selecionados e relacionados às características do rebanho, práticas de manejo, procedimentos relacionados ao controle e prevenção das doenças e características individuais. Após a seleção do modelo final de regressão logística serão observados os coeficientes beta de cada variável independente para se estimar o grau de risco (“ODDS RATIO” – OR).

Responsável: Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro
Colaboradores: Janaína Fadrique da Silva
Instituição: Centro de Pesquisa Agropecuária de Clima Temperado
Orçamento * Materiais de Consumo: R$17.129,00


3. Identificação e isolamento das sorovares de leptospira mais prevalentes nos rebanhos leiteiros

Descrição: Esta atividade será realizada no laboratório de Vacinologia no Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Núcleo Biotecnologia da UFPel. Será efetuado o diagnóstico de leptospirose pelo teste de soroaglutinação microscópica (MAT; Faine et. 1999) com a utilização de 18 sorovares cultivadas. Também serão utilizadas sorovares identificadas inicialmente no projeto EPIREP 1. Assim será constatada a maior prevalência das sorovares com seu isolamento em cultivo. Será realizada a técnica de aglutinação microscópica (MAT) em todas as amostras conforme protocolo previamente descrito (WHO, 2003). Para este fim, cada soro será diluído 1:50 em solução tampão PBS para a triagem e titulação. Serão utilizados 13 sorovares para a realização do teste: Autumnalis, Canicola, Copenhageni, Djasiman, Grippotyphosa, Hardjobovis, Hardjoprajino, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Panama, Pomona, Shermani e Tarassovi. As cepas utilizadas serão mantidas em meio de cultura líquido Elinghausen McCullough Johnson Harris Modificado-EMJH (Difco TM) suplementado com albumina 8 a 10%, com repiques semanais e incubação a 30°C. As placas de 96 cavidades serão incubadas por 2 horas em estufa à temperatura de 30°C. As leituras são realizadas utilizando-se microscópio de campo escuro com condensador a seco, com lâmina na objetiva de 20x, verificando a presença ou ausência de aglutinação. Na triagem os soros são testados a partir da diluição de 1:100, sendo considerados positivos aqueles que apresentaram aglutinação igual ou maior que 50%, em comparação ao controle. As amostras reagentes serão diluídas em diluições crescentes de 1:100 até 1:3200, para determinação do título final de anticorpos. O sorovar com maior título na MAT será considerado o sorovar prevalente. Após será realizada a análise estatística por meio da análise univariada do qui quadrado de Pearson por meio do software SPSS versão 20.0, considerando p≤0,05 como significante. A técnica de isolamento das leptospiras pode ser realizada a partir da coleta de urina por punção vesical em matadouro, como também fragmentos de órgãos como rim, fígado, corpo uterino e ovário. O meio utilizado para o isolamento é o Ellinghausen-McCullough-Johnson Harris modificado (EMJH) (Difco-TM), suplementado com albumina 8 a 10%. São realizadas duas culturas da mesma amostra, uma com antibiótico 5-fluouracil e uma sem antibiótico que são incubadas por 7 dias a 30°C. O inoculado utilizado para o isolamento corresponde a 10 % do volume do meio de cultura. Os fragmentos de rim, fígado, corpo uterino e ovário são triturados e diluídos a 1:10 em soluções estéreis de tampão fosfato (PBS) PH 7,4, cerca de duas horas após a coleta, sendo posteriormente cultivada em EMJH. As culturas serão avaliadas por até 16 semanas para a verificação de leptospiras presentes (ELLIS et al. 1982).

Responsável: Odir Antônio Dellagostin
Instituição: Universidade Federal de Pelotas
Colaboradores: Janaína Fadrique da Silva
Orçamento *Materiais de Consumo: R$17.129,00


4. Identificação do N.caninum nas células germinativas e sua implicação no desenvolvimento embrionário inicial em bovinos

Descrição: As tecnologias de reprodução assistida (TRA) em bovinos são amplamente utilizadas para multiplicação de material genético superior. A utilização destas tecnologias possui grande impacto no controle da transmissão de alguns patógenos. No entanto, no caso da neosporose, ainda não foram estabelecidas normas quanto a sua transmissibilidade via gametas. Neste contexto o objetivo desta atividade é avaliar a possível transmissão do N. caninum via células germinativas em animais “naturalmente” infectados com o agente, em condições normais ou de estresse. Adicionalmente visa elucidar a ação do agente no desenvolvimento embrionário inicial em bovinos. Desta forma, aportar avanço no conhecimento quanto as regras de transmissibilidade e, portanto, do controle das perdas reprodutivas e econômicas associadas ao agente. As ações desta atividade serão desenvolvidas nos laboratórios de Reprodução Animal da Embrapa Clima Temperado e do Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Núcleo Biotecnologia da UFPel. Para avaliação da transmissibilidade via gameta feminino serão realizadas aspirações foliculares in vivo (quinzenalmente) em doadoras com sorologia positiva ao agente alocadas na Embrapa Clima Temperado (n=12). Inicialmente será efetuada a sincronização do crescimento folicular com posterior aspiração in vivo dos folículos. Serão efetuadas no mínimo 10 repetições para obtenção do liquido folicular e recuperação dos ovócitos. No laboratório as amostras de liquido folicular serão analisadas individualmente para a seleção de ovócitos viáveis. Ovócitos de grau I e II serão destinados ao laboratório do Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Núcleo Biotecnologia da UFPel para a detecção via reação de polimerase em cadeia (PCR). A metodologia para extração de DNA e reação de PCR será utilizada de acordo com os métodos descritos por Cunha Filho e colaboradores (2017). Para avaliação da transmissibilidade via gameta masculino serão realizadas coletas de sêmen em doador reagente ao N. caninum. O material coletado será encaminhado ao mesmo laboratório descrito anteriormente e será submetido aos mesmos processos de extração de DNA e de reação de PCR com a mesma metodologia descrita. Serão realizadas no mínimo 20 coletas de sêmen do mesmo animal. Para avaliação da ação do agente sobre o desenvolvimento embrionário inicial em bovinos serão realizadas rotinas de produção in vitro (PIV) de embriões dos mesmos doadores de material genético reagentes ao N. caninum. A metodologia de PIV de embriões bovinos será a de rotina do laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Clima Temperado. Os resultados de desenvolvimento embrionário e rendimento global serão comparados com os obtidos com material genético de outros doadores livres de N. caninum nas mesmas rotinas de PIV. Serão realizadas 20 rotinas de PIV de embriões bovinos com material genético reagente e não reagente, simultaneamente.

Coleta das Amostras Sanguíneas e Aplicação do Questionário Epidemiológico
Avaliação das Soroprevalências de IBR, BVD e Neospora através de Kit Comerciais
Avaliação da Soroprevalência de Leptospirose
Quantificação dos Fatores de Risco
Identificação e isolamento das Sorovares de Leptospira mais prevalentes
Identificação do DNA do Neospora Caninum nas Células Germinativas
Avaliação do Desenvolvimento Embrionário In Vivo