Nome do Projeto
PADRONIZAÇÃO DE KIT GENOTIPAGEM PARA PREDISPOSIÇÃO DE OBESIDADE E SUAS COMORBIDADES
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/03/2023 - 30/11/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências da Saúde
Resumo
A obesidade é um problema de saúde pública que tem como consequência uma série de doenças a ela relacionada, como diabetes mellitus tipo 2, síndrome metabólica e doenças cardíacas entre outras. Esta doença é causada por diversos fatores ambientais e socioculturais, mas tem um importante fator genético na predisposição a ela e às suas comorbidades. Diante do avanço das técnicas de genotipagem dos polimorfismos genéticos relacionados a diversas doenças, o mundo tem a tendência na evolução de sistemas que abrangem todo o genoma, trazendo em apenas uma análise milhões de resultados com um custo cada vez menor. No entanto, apenas um grupo de duas dezenas de polimorfismos são realmente interessante para o diagnóstico genético de predisposição a estas condições acimas descritas, sendo que o restante serve apenas para confundir aos clínicos envolvidos. Além disso, apenas alguns laboratórios com equipamentos específicos são capases de realizar estes exames, fazendo com que a genotipagem ainda se mantenha em um campo distante da prática da clínica médica. O presente trabalho tem o objetivo de padronizar reações de PCR para evidenciar os genótipos das pessoas com relação à obesidade e suas comorbidades. Adicionalmente visa também criar um Kit de genotipagem que exija apenas um termociclador e um sistema de eletroforese simples para o diagnóstico genético, oferecendo inclusive um algorítimo para orientação do clínico na análise do resultado. Estes equipamentos já são comuns em laboratórios de análises clínicas comerciais espalhados em todo o Brasil, criando se assim um produto comercial interessante e acessível a toda comunidade médica no auxílio ao combate da pandemia de obesidade que atinge nosso país.
Objetivo Geral
Padronizar uma ferramenta biotecnológica simples, eficiente, com baixo custo e de fácil aplicação para genotipagem por tetra-primes ARMS-PCR para polimorfimos genéticos ligados à obesidade.
Justificativa
O fenótipo da obesidade vem aumentando nas últimas décadas e acredita-se que as causas para este distúrbio complexo estejam relacionadas com um desequilíbrio entre a ingestão de energia e o gasto de energia devido a mudanças nos estilos de vida, incluindo a exposição a um ambiente não favorável. Além disso, estima-se que a predisposição hereditária a obesidade pode variar de 40 a 70% (ALBUQUERQUE et al., 2014). Sendo assim, é provável que a resposta ao manejo do peso possa incluir a compreensão da genética individual. Futuramente, testes específicos poderão fornecer previsões exatas sobre a resposta de um indivíduo a uma determinada dieta (PEREIRA FILHO et al., 2021).
Metodologia
Coleta de material biológico
Para coleta de material biológico, será utilizada raspagem de células das bochechas com swab bucal de voluntários conhecidos, pois a coleta terá que ser repetida mais de uma vez. O swab precisará ser esfregado no interior da boca e debaixo da língua por cerca de dez segundos. O atrito criado entre o ato de esfregar o cotonete na mucosa da boca faz com que as células penetrem e fiquem presas ao cotonete, por meio da saliva. Tecnicamente, essas células são chamadas de células epiteliais descamadas. As linhas das membranas epiteliais estão muitas vezes nas cavidades do nosso corpo, incluindo boca e o interior do nariz. É a partir dessas células que o DNA será extraído. Após, feita a extração das células, elas serão deixadas para secar por cerca de uma hora podendo então ser transportadas a temperatura ambiente (MELO et. al, 2010) e armazenado em freezer a temperatura de -20°C (MARTINEZ et. al, 2018).
Extração DNA genômico
Para extração do DNA genômico o SWAB será colocado em eppendorf com 300 µl do tampão de lise (TRIS Hcl 1 M pH 8,5; 0,5 EDTA pH 8; SDS; NaCL) e 10 µl de proteinase K passará por vortex e ficará incubo a 55°C por 4 horas. Então será realizado spin e retirado o SWAB (seco). Será adicionado 100 µl de NaCl e dar vortex. Após isso amostra ficará no gelo por 5 minutos e centrifugada a 12000 rpm por 3 minutos. O sobrenadante será transferido para outro eppendorf de 1,5 mL com 300 µl de isopropanol e misturado com a mão vagarosamente. Incubado por 5 minutos e centrifugado a 12000 por 5 minutos. Após isto, o tubo será lavado 1x com etanol 70% (500 µl) e o pallet será seco. Então será suspendenso em 50 µl de tampão T.E. (TRIS Hcl 100mM, pH 7,4; EDTA 0,5 M pH 8).
Desenvolvimento dos primers para cada SNP
Verificação se o polimorfismo poderá ser ajustado para diagnóstico com ARMS–PCR.
Inicialmente será realizada a busca no PubMed e identificação dos polimorfismos genéticos a serem estudados, será utilizada o banco de dados SNPedia e desta forma se aprofundar na quantidade de informações acerca de cada um dos polimorfismos selecionados, será utilizada a ferramenta dbSNP que está linkada ao site SNPedia.com para coletar frequências alélicas e visualizar a região do DNA que se encontra o SNP selecionado e as suas características.
Obtenção da sequência periférica ao polimorfismo com marcações de SNPs, regiões repetitivas, exons e introns
Após isto a ferramenta BLAT disponibilizada pela Santa Cruz Univerity of California Genomics Institute localizado no website https://genome.ucsc.edu/ será utilizada afim de verificar a sequência de 1000 pares de bases no entorno do polimorfismo estudado. O objetivo será identificar possíveis locais dentro desta sequência para confecção dos primers.
Desenho de prováveis sequências de iniciação
Com a sequência identificada será utilizada outra ferramenta online chamada OligoPerfect Primer Designer disponibilizada pela ThermoFisher (www.thermofisher.com) e desta forma serão escolhidos primers específicos para cada sequência de cada polimorfismo genético.
Verificação do viés intrínsicos das sequências escolhidas
Após a escolha dos primers será então utilizado o programa GeneRunner para confirmação dos primers escolhidos e verificação da temperatura de anelamento, e de outros problemas que podem ocorrer como hairpin loops, dimers, bulge loops, internal loops, e match sites.
Verificação de especificidade das sequências escolhidas
Depois disso as sequências dos primers serão novamente verificadas no BLAT confirmando sua ocorrência especifica no local próximo da variação genética correspondente desta forma evitando amplificação de outras regiões do DNA.
Confirmação dos resultados obtidos
A confirmação será feita por sequenciamento pelo método de SANGER. Para isso, os primers externos e os amplicons das PCRs serão enviados para confirmação de sequenciamento em laboratórios comerciais, afim de se obter 100% de confirmação dos resultados.
Desenvolvimento do kit diagnóstico de acordo com o perfil poligênico
Serão testadas várias tecnologias biotecnológicas para facilitar a obtenção dos kits de forma prática e de baixo custo para obter os resultados desejados nos kits poligênicos a serem desenvolvidos.
Para coleta de material biológico, será utilizada raspagem de células das bochechas com swab bucal de voluntários conhecidos, pois a coleta terá que ser repetida mais de uma vez. O swab precisará ser esfregado no interior da boca e debaixo da língua por cerca de dez segundos. O atrito criado entre o ato de esfregar o cotonete na mucosa da boca faz com que as células penetrem e fiquem presas ao cotonete, por meio da saliva. Tecnicamente, essas células são chamadas de células epiteliais descamadas. As linhas das membranas epiteliais estão muitas vezes nas cavidades do nosso corpo, incluindo boca e o interior do nariz. É a partir dessas células que o DNA será extraído. Após, feita a extração das células, elas serão deixadas para secar por cerca de uma hora podendo então ser transportadas a temperatura ambiente (MELO et. al, 2010) e armazenado em freezer a temperatura de -20°C (MARTINEZ et. al, 2018).
Extração DNA genômico
Para extração do DNA genômico o SWAB será colocado em eppendorf com 300 µl do tampão de lise (TRIS Hcl 1 M pH 8,5; 0,5 EDTA pH 8; SDS; NaCL) e 10 µl de proteinase K passará por vortex e ficará incubo a 55°C por 4 horas. Então será realizado spin e retirado o SWAB (seco). Será adicionado 100 µl de NaCl e dar vortex. Após isso amostra ficará no gelo por 5 minutos e centrifugada a 12000 rpm por 3 minutos. O sobrenadante será transferido para outro eppendorf de 1,5 mL com 300 µl de isopropanol e misturado com a mão vagarosamente. Incubado por 5 minutos e centrifugado a 12000 por 5 minutos. Após isto, o tubo será lavado 1x com etanol 70% (500 µl) e o pallet será seco. Então será suspendenso em 50 µl de tampão T.E. (TRIS Hcl 100mM, pH 7,4; EDTA 0,5 M pH 8).
Desenvolvimento dos primers para cada SNP
Verificação se o polimorfismo poderá ser ajustado para diagnóstico com ARMS–PCR.
Inicialmente será realizada a busca no PubMed e identificação dos polimorfismos genéticos a serem estudados, será utilizada o banco de dados SNPedia e desta forma se aprofundar na quantidade de informações acerca de cada um dos polimorfismos selecionados, será utilizada a ferramenta dbSNP que está linkada ao site SNPedia.com para coletar frequências alélicas e visualizar a região do DNA que se encontra o SNP selecionado e as suas características.
Obtenção da sequência periférica ao polimorfismo com marcações de SNPs, regiões repetitivas, exons e introns
Após isto a ferramenta BLAT disponibilizada pela Santa Cruz Univerity of California Genomics Institute localizado no website https://genome.ucsc.edu/ será utilizada afim de verificar a sequência de 1000 pares de bases no entorno do polimorfismo estudado. O objetivo será identificar possíveis locais dentro desta sequência para confecção dos primers.
Desenho de prováveis sequências de iniciação
Com a sequência identificada será utilizada outra ferramenta online chamada OligoPerfect Primer Designer disponibilizada pela ThermoFisher (www.thermofisher.com) e desta forma serão escolhidos primers específicos para cada sequência de cada polimorfismo genético.
Verificação do viés intrínsicos das sequências escolhidas
Após a escolha dos primers será então utilizado o programa GeneRunner para confirmação dos primers escolhidos e verificação da temperatura de anelamento, e de outros problemas que podem ocorrer como hairpin loops, dimers, bulge loops, internal loops, e match sites.
Verificação de especificidade das sequências escolhidas
Depois disso as sequências dos primers serão novamente verificadas no BLAT confirmando sua ocorrência especifica no local próximo da variação genética correspondente desta forma evitando amplificação de outras regiões do DNA.
Confirmação dos resultados obtidos
A confirmação será feita por sequenciamento pelo método de SANGER. Para isso, os primers externos e os amplicons das PCRs serão enviados para confirmação de sequenciamento em laboratórios comerciais, afim de se obter 100% de confirmação dos resultados.
Desenvolvimento do kit diagnóstico de acordo com o perfil poligênico
Serão testadas várias tecnologias biotecnológicas para facilitar a obtenção dos kits de forma prática e de baixo custo para obter os resultados desejados nos kits poligênicos a serem desenvolvidos.
Indicadores, Metas e Resultados
Depósitos de patentes
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| AMANDA BARBOSA ATRIB | |||
| CARLOS CASTILHO DE BARROS | 4 | ||
| CLÉDIA SILVEIRA FLORES DA SILVA | |||
| MARCELLO DE SOUZA ALVES |