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O SNC reage a danos traumáticos e infecciosos por meio de uma resposta imune envolvendo células da glia, como astrócitos e micróglia juntamente com a liberação de pró-inflamatórios sendo esse evento chamado de neuroinflamação. Nesse contexto, os astrócitos têm se tornado um dos alvos nas pesquisas científicas, devido seu papel na manutenção da homeostasia do encéfalo, integridade da barreira cérebro-sangue, bem como da astrogliose, o qual configura-se em alterações morfológicas e fisiológicas com envolvimento da secreção de citocinas, como TNF, IL-6 e IL-1β, e estresse oxidativo. Para a indução de neuroinflamação experimental tem sido utilizado o LPS, uma classe de glicolipídeos de membrana presentes em bactérias gram-negativas. O LPS provoca mudanças na expressão de citocinas pró-inflamatórias, expressão e atividade de enzimas ectonucleotidases, e afeta a atividade da AChE . Em suma, essa classe de glicolipídeo tem se apresentado como um adequado indutor de neuroinflamação tanto em experimentos in vitro quanto em in vivo e tem sido muito utilizado para avaliar o potencial neuroprotetor de compostos naturais frente a eventos inflamatórios sistêmicos ou centrais. Neste contexto, um dos compostos que tem chamado a atenção nos últimos anos é o AE. O AE é um polifenol presente em altas concentrações em vegetais e frutas, tais como romã, morango, framboesa e nozes, o qual apresenta atividade antioxidante e neuroprotetora já descrita na literatura. Além disso, também tem sido descrito que o AE possui ação anti-inflamatória modulando mecanismos relacionados a óxido nítrico sintase induzível, ciclo-oxigenase 2 e citocinas com ação pró-inflamatória, tais como, a IL-6 e a IL-1β. Desta forma, acredita-se que o AE possa apresentar um potencial terapêutico promissor no controle da neuroinflamação, por atuar modulando a liberação de medidores relacionados a resposta astrocitária.

Cultura primária de astrócitos:

Ratos Wistar neonatos (1-3 dias) serão eutanasiados por decapitação, o córtex será isolado e dissociado mecanicamente em tampão fosfato (pH 7,6) livre de Ca+2 e de Mg+2 (CMF). O tecido dissociado será submetido à centrifugação a 1000 rpm durante 10 minutos. Após, o CMF será retirado e as células serão suspensas em meio de cultura DMEM suplementado com 10% SFB. As células serão semeadas em placas de 24 poços (2x105 células/poço) e cultivadas durante 20 dias em estufa a 37ºC em atmosfera umidificada 5% de CO2.

Tratamento de astrócitos com lipolissacarídeo (LPS) e ácido elágico (AE):

As culturas primárias de astrócitos serão expostas a 1 μg/ml de LPS por 3 h. Em seguida, o meio contendo LPS será removido e um novo meio contendo diferentes concentrações de AE será adicionado a cada grupo por 24 e 48 h e 72 h. Uma solução estoque de AE será preparada em dimetilsulfóxido (DMSO) e usada para obter concentrações finais de 50, 100, e 200 μM de modo que a porcentagem de DMSO por ml de meio seja inferior a 1%. As células de controle foram mantidas em DMEM com 10% de FBS e 15 μl de DMSO por ml de meio.

Teste de viabilidade celular:

Para avaliar a viabilidade celular será realizado o ensaio de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Após o período de tratamento (24, 48 ou 72h), as células serão gentilmente lavadas com CMF e, em seguida, 85 serão adicionadas ao meio de cultura 50 μL do reagente MTT (0,5 mg/mL) por poço. Posteriormente, as células serão incubadas por 90 min em estufa a 37 °C e em atmosfera com 5% de CO2. Após, o MTT será removido e o precipitado formado será eluído em 50 μL de DMSO. A leitura das absorbâncias será realizada em um leitor de microplacas a 492 nm.

Teste de proliferação celular por sulforrodamina B:

Esse método é baseado na capacidade que a sulforrodamina B (SRB) possui de se ligar a componentes proteicos das células, fixados pelo ácido tricloroacético (TCA). Assim, independe da atividade metabólica das células, conseguindo determinar a densidade celular. Os astrócitos serão expostos ao LPS (1 µg/mL) durante 3 horas e em seguida serão submetidos ao tratamento com ácido elágico por 24h ou 48h. Após será removido o meio e adicionado 200 µL de TCA 50%. Em seguida, o TCA será removido e adicionado solução SRB e a placa será novamente incubada por 30 minutos. Essas células, então, deverão ser lavadas 5 vezes com ácido acético 1% para a remoção do corante não incorporado. A leitura das absorbâncias deverá ser realizada em leitor de microplacas, utilizando-se o comprimento de onda de 530 nm.

Parâmetros de estresse oxidativo:

Os níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) será avaliado através do método fluorescente baseado na oxidação da 2,7-dicloro-dihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA) em diclorofluoresceína (DCF) e o resultado expresso em percentual do controle. Os níveis de nitrito através da reação de Griess e Os resultados serão expressos em mol de NO2-/mg de proteína. A determinação dos níveis de tióis totais será baseado na redução do ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) pelos grupos tióis e os resultados serão expressos como nmol de TNB/mg de proteína. A análise de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) será conforme método previamente descrito na literatura e expresso em nmol de TBARS/mg de proteína. A atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) será realizada de acordo com Misra e Fridovich (1972) e os resultados serão expressos em unidades/mg de proteína. A atividade da catalase será pelo método de Aebi (1984) e expressa em unidades/mg de proteína, sendo uma unidade de CAT definida como 1 µmol de H2O2 consumido por minuto.


Determinação de citocinas:

A determinação de citocinas será realizada no sobrenadante das culturas por método de ensaio imunoenzimático (ELISA), segundo determinado por kit comercial, para TNF, IL-1β e IL-6.
Determinação da atividade das enzimas acetilcolinesterase e Na+K+ -ATPase
A determinação da AChE será baseada na formação do ânion amarelo 5-tio-2-nitrobenzoato que determinado a 412 nm e a atividade da enzima será expressa em μmol AcSCh/hora/mg de proteína. A atividade da Na+K + -ATPase será realizado no lisado celular preparado com água estéril. Neste ensaio será utilizado um meio de incubação contendo 5,0 mM de 20 MgCl2, 80,0 mM de NaCl, 20,0 mM de KCl e 40,0 mM de Tris-HCl, pH 7,4. A reação será iniciada após a adição de ATP a uma concentração final de 3,0 mM. Os controles foram realizados sob as mesmas condições com a adição de 1,0 mM de ouabaína. A atividade da Na+, K+ATPase será calculada pela diferença entre os dois ensaios, conforme descrito por Wyse et al., (2007) e o fosfato inorgânico (Pi) liberado foi medido pelo método de Chan et al., (1986). A atividade específica da enzima foi expressa em nmol Pi liberado por min por mg de proteína.

Atividade das enzimas do sistema purinérgico:

As atividades ATPásicas, ADPásicas e AMPásicas serão mensuradas pelo método do verde de malaquita segundo Chan et al. (1986) e as concentrações de proteína serão determinadas pelo método do Coomassie Blue usando proteína albumina como padrão.

Análise estatística:
As análises estatísticas serão ANOVA de uma via seguida do teste de Tuckey para comparações múltiplas, através programa GraphPad. Os resultados serão expressos como média ± erro padrão e valores serão considerados significativos quando P < 0,05.

Pretende-se demonstrar um efeito biológico promissor e multialvo do ácido elágico com significativa repercussão técnico-científica na área aplicada a novos prováveis fármacos dentro do contexto da neuroinflamação. O desenvolvimento deste projeto será importante para a formação de recursos humanos, uma vez que será desenvolvido por alunos de mestrado, doutorado e de iniciação científica sob a supervisão da coordenadora deste projeto. A realização das atividades em tempo hábil, a publicação de artigos científicos em periódicos internacionais e a formação de recursos humanos em nível de graduação e de pós-graduação também serão utilizados como indicadores de progresso.